环氧大豆油酸-寡聚乳酸修饰纳米羟基磷灰石的制备及其聚乳酸复合材料性能研究

＊易文君 陈云 李立军 沈奕 张跃飞 晁自胜*

（1.长沙理工大学 材料科学与工程学院 湖南 410082 2.湖南理工学院 化学化工学院 湖南 414006 3.中南大学湘雅第二医院骨科 湖南 410011）

骨组织的再生能力有限，在骨固定和修复应用中，生物可吸收材料被认为是一种理想的生物材料，其中聚合物可以被人体吸收代谢，避免二次手术来移除金属植入物[1]。聚（L-乳酸）是目前骨再生植入物应用最广泛的物质之一，可降解为无毒可代谢乳酸，在组织工程、缝合、植入和药物输送等方面显示出潜在的应用前景[2]。但其骨传导性和骨诱导性较差，不能直接应用于骨修复工程。将羟基磷灰石（HA）与聚乳酸（PLLA）混合制备陶瓷/聚合物复合材料，可提高聚乳酸骨的诱导性。

环氧大豆油（ESBO）来源广泛、无毒、易被人体代谢、具有良好的生物相容性，可应用于生物材料[3]。ESBO曾被用于塑料及橡胶等聚合物的增塑，可提高其柔韧性。在HA/PLLA复合材料体系中，ESBO可作为偶联剂及增塑剂，增强其界面相容性[4]。有望提升其力学性能及生物性能。

1.实验部分

(1)实验试剂

CaCl2，Na3PO4·12H2O，NaOH，环氧大豆油。实验室条件下制备寡聚乳酸（OPLA，粘均分子量约为6000）。聚（L-乳酸）（PLLA），型号为4032D（分子量约为1.67×105g/mol）。

(2)材料合成

①n-HA及ESBO-HA合成

500ml CaCl2（0.4M）为溶液A，用NaOH（0.1M）溶液缓慢滴加，调节其pH一直保持在9～10，并在水浴锅中将其加热至60℃。取适量Na3PO4加入去离子水中配置为300ml溶液B（0.3mol），将溶液B缓慢滴加至溶液A中，不停搅拌，用NaOH维持其pH一直处于9.0～10.0范围内，持续30min。30min后停止搅拌，溶液静置24h后进行过滤，并用去离子水冲洗残余滤渣5次，将其放入冷冻干燥箱中，在-20℃下干燥24h，随后取出研磨得到粉末，命名为n-HA。

通过计算适当配比，取0.6g环氧大豆油，将其滴入50ml NaOH（1mol/L）溶液中水解，得到产物环氧大豆油酸（ESBO），随后按照上述相同步骤进行处理，得到产物为ESBO-HA。

②ESBO-OPLA-HA和OPLA-HA合成

先取1.0g n-HA加入至schlenk瓶中，再取质量比为HA两倍的OPLA 2.0g置于其中。取0.02g三乙胺作为催化剂，20ml二甲苯作为溶剂加入瓶中。在氮气环境下于130℃下反应24h，随后冷却离心得到沉淀物，用二氯甲烷重复洗涤5次，放入真空干燥箱中，设置温度为40℃，静置干燥24h，所得产物命名为OPLA-HA。

ESBO-HA按照上述相同步骤进行处理，所得产物命名为ESBO-OPLA-HA。

③含聚乳酸的HA或改性HA共混物的制备

配置8ml CHCl3和丙酮的混合溶液（CHCl3和丙酮的体积比为5:1），取定量HA，ESBO-HA或ESBO-OPLA-HA分散至其中，超声1h。然后按照计算比例取一定量的PLLA加入到该混合物溶液中，高速搅拌4h。随后将混合物溶液倒入培养皿中，置于真空干燥箱中，50℃下干燥6h，等待溶剂挥发。将所得薄片用平板热压机热压1min，温度为140℃，压力为10MPa，得到薄片状复合材料分别命名为HA/PLLA，ESBO-HA/PLLA及ESBO-OPLA-HA/PLLA。将所得薄片进行机械切割，获得长方形薄片（50mm×10mm×0.1mm），将其置于酒精中超声，清洗表面杂质，干燥后测量其拉伸性能。

(3)材料表征及测试方法

XRD：采用德国Bruker D8 ADVANCE型X射线衍射仪对其进行物相分析。扫描速度5°/min，步长为0.02°，范围为5°～80°。

FT-IR：扫描范围为400～4000cm-1，扫描次数为64次，采用美国Varian 3100型红外光谱仪进行测试。

热重分析：测试范围为30～800℃，升温速率为10℃/min，在空气氛围中进行，采用TA SDT Q500热重测试仪器进行测试。

SEM：将粉末样品加入乙醇中，超声分散，滴在硅片上，随后置于真空干燥箱中，干燥10h，进行测试。将复合薄膜材料置于液氮中浸泡，随后迅速撕成小碎片状，对其截面进行喷金2min，进行测试。测试仪器为Philips XL30E-SEM-FEG扫描电子显微镜。

(4)生物性能测试

①细胞与材料共培养。材料制备与细胞培养和文献[5]一致。

②细胞增殖测试。取一定量的样品配成相应浓度置于培养样板上，样板为96孔，将MSCs细胞（1×104细胞/孔）接种到样品上进行培养，培养时间分别为24h、48h和72h。随后用混合溶液替换原来的培养基，继续培养3h，温度为37℃。转移一定量细胞混合培养基置于新的样板中，测试吸光度。MSCs细胞数量通过细胞计数法Kit-8（CCK-8，Dojindo）测试得到。

(5)机械性能测试

将薄膜样品在室温下以拉伸速度为1mm/min的条件用万能试验机进行测试，万能试验机型号为CMT6000，Sans，China。每组样品测试3次，取其平均值。拉伸强度和断裂伸长率通过公式（1）和公式（2）计算。

拉伸强度(MPa)=拉伸力(F)/截面面积(S)（1）

断裂伸长率(%)=ΔL(mm)/L(mm)×100% （2）

2.结果与讨论

(1)改性填料表征结果

n-HA，ESBO-HA，OPLA-HA和ESBO-OPLA-HA的XRD图谱如图1(A)所示。图1(A)中a、b、c、d为合成的四种样品的X射线衍射谱图，均具备羟基磷灰石的衍射峰，主要衍射峰与PDF卡片（JCDPS:090432）对应。改性前后，衍射峰无明显变化，说明改性不会改变其晶型结构。图1(B)为OPLA，n-HA，OPLA-HA，ESBO-HA和ESBO-OPLA-HA的红外光谱图。不同材料在562cm-1、630cm-1、962cm-1和1028cm-1处的衍射峰为磷酸基团振动[6]。

图1 不同材料的XRD谱图和FT-IR图

这四个位置的衍射峰在n-HA进行改性前后都没有发生变化，说明ESBO和OPLA的改性过程没有影响到HA的晶体结构。图1(B)中c，2800cm-1～3000cm-1处的衍射峰为ESBO上的-CH2-和CH3的振动吸收峰，图1(B)中d，2800cm-1～3000cm-1处的衍射峰属于ESBO或OPLA上的-CH2-或-CH3的振动吸收峰。1570cm-1和1480cm-1处的吸收峰属于改性后羧基的振动。通过对FT-IR图的分析，可以证明ESBO中的羧基与HA中的Ca2+在搅拌过程中发生螯合，说明通过共沉淀法成功将ESBO接枝到了HA表面，同时在OPLA-HA中ESBO的吸收峰未出现，说明OPLA无法直接接枝在HA的表面，需要通过ESBO接枝在HA表面的条件，OPLA才能接枝到HA的表面，形成复合材料。

n-HA，ESBO-HA，OPLA-HA以及ESBO-OPLA-HA系列材料的失重率结果如表1所示。从表1可以看出，n-HA失重为5.2%，主要是HA中结晶水以及自由水的挥发。对于ESBO-HA而言，总热失重为8.3%，前5.2%是由HA中的结晶水以及自由水挥发导致，后续失重3.1%为接枝在HA表面上的ESBO分解引起。ESBO-OPLA-HA热失重为10.2%，其中5.2%为HA中结晶水以及自由水的挥发，3.1%为接枝在HA表面上的ESBO分解，1.9%为接枝在HA表面上的OPLA在高温下分解。

图2(a)为n-HA，可以观察到HA呈片层状团聚分布在一起，当HA在强碱性环境中合成时，HA最终形成片层状形貌堆叠在一起。图2(b)为OPLA改性之后的OPLA-HA的形貌，相对图2(a)，分散没有那么密集，且片层状相对较小，可能是OPLA分布在HA表面上，使HA互相间隔开，HA相对分散，形成小块层状团聚在一起。图2(c)为ESBO-HA的SEM图，可以在图中观察到ESBO-HA颗粒相对较分散，呈细针状分布，少量团聚在一起，ESBO可能在反应过程中发挥了表面活性剂的作用，引导HA长成针状，难以团聚在一起形成片层状。图2(d)为ESBO-OPLA-HA，可以在图中观察到，ESBOOPLA-HA颗粒呈针状，相较于图2(c)，少量团聚，可能是在表面改性的过程中，OPLA成功接枝到HA表面，使HA在合成过程中分散开，不易团聚。

图2 HA及其改性材料的SEM图

为了测试材料改性之后分散效果是否得到改善，取一定量n-HA、OPLA-HA、ESBO-OPLA-HA分别加入氯仿溶液中，超声一定时间，形成悬浮液，观察其分散情况。从图3可以观察到，n-HA无法稳定地悬浮于氯仿溶液中，数分钟后颗粒开始沉淀。与n-HA相比，OPLA-HA能以相对稳定且均匀的状态在氯仿溶液中分散8h。ESBO-OPLA-HA分散稳定性最好，能够在氯仿溶液中稳定分散达到48h。可以得出结论，用ESBO和OPLA对HA进行表面改性之后，能够显著提升复合材料的疏水性。

图3 HA及改性HA氯仿悬浊液的稳定性

(2)HA和改性HA的生物相容性

图4为在不同材料上培养MSC细胞之后的存活情况。从图中观察到当质量浓度为1.0mg/mL时，HA对于MSC细胞存在一定的影响，当培养时间从24h到72h之后，细胞存活率下降了41.6%。ESBO-HA影响相对较小，培养时间从24h到72h之后，细胞存活率下降43.6%。ESBO-OPLA-HA影响最小，培养时间从24h到72h之后，细胞存活率仅下降17.6%[7]。当加入ESBO和OPLA在HA表面进行改性之后，增加了复合材料的疏水性能，阻止了HA中Ca2+渗出，从而使MSC细胞存活率提升，说明了进行表面改性之后，复合材料的生物相容性提升，ESBO-OPLA-HA为极具潜力的骨修复材料。

图4 MSC细胞在n-HA，ESBO-HA以及ESBO-OPLA-HA上不同时间之后的存活率

(3)热压工艺制备的HA/PLLA复合材料性能研究

HA，ESBO-HA以及ESBO-OPLA-HA材料的拉伸强度为ESBO-OPLA-HA/PLLA最高，ESBO-HA/PLLA次之，HA/PLLA在三者中最低。相比HA/PLLA，聚合物接枝改性的HA填料能够提升PLLA复合材料的拉伸强度，提高约16.9%。从图5中可知三种复合材料的断裂伸长率都处于6%附近，相差不大，刚性HA纳米颗粒的加入并没有降低其断裂伸长率。ESBO-OPLA-HA/PLLA和ESBO-HA/PLLA复合材料拉伸强度得到提升的原因，一方面是OPLA和ESBO在HA表面改性之后形成一层缓冲层，且两者都为有机物，可以与PLLA缠绕在一起；另一方面为ESBO和OPLA的加入可以使HA颗粒在PLLA中分散更加均匀。在未改性时，HA颗粒容易在PLLA基体中团聚呈大块颗粒，造成应力缺陷，界面黏附性差，从而导致拉伸强度降低。ESBO-OPLA-HA和PLLA在溶剂中共混时，HA表面上的OPLA分子能够帮助HA在PLLA中均匀分布，且降低了颗粒团聚程度，提升了HA与PLLA之间的界面黏附性，复合材料的拉伸强度得到提升。

图5 系列HA复合填料对PLLA基复合材料拉伸性能影响

图6为HA/PLLA、ESBO-HA/PLLA和ESBO-OPLA-HA/PLLA三种复合材料在用液氮处理后材料断面的SEM图。可以从图中观察到，复合材料断面上存在少量裂纹或缺陷。三种复合材料在PLLA基体中仍存在团聚，团聚程度HA＞ESBO-HA＞ESBO-OPLA-HA。说明加入OPLA和ESBO对HA表面进行改性之后能够改善HA在PLLA基体中的分散，增强了两者之间的界面结合力。从力学性能分析中也能验证此结论，ESBO-OPLA-HA/PLLA复合材料的力学性能优于HA/PLLA复合材料。

图6 HA/PLLA，ESBO-HA/PLLA以及ESBO-OPLA-HA/PLLA断面SEM图

3.结论

本文探索了用ESBO和OPLA共同改性纳米羟基磷灰石，作为填料制备聚乳酸复合材料的力学性能和生物性能的影响。ESBO-OPLA-HA疏水性增强，在氯仿溶液中分散性更好，悬浮时间长达48h。生物性能测试结果中，MSC细胞在改性的ESBO-OPLA-HA上培养之后存活率提升，相比未改性的HA毒性更低。通过溶液共混及热压法制备的ESBO-OPLA-HA/PLLA复合材料的拉伸强度相比HA/PLLA拉伸强度提升约16.9%，断裂伸长率影响较小。ESBO-OPLA-HA优良的生物相容性和相对适中的力学性能使得ESBO-OPLA-HA成为一种有潜力的生物可吸收高分子的填料。