食品中植物源成分分子生物学检测技术及应用研究综述

◎王 妮

（长春职业技术学院,辽宁 大连 130033）

近年来，我国推崇“五谷”“五菜”“五果”主题饮食。能够改善我国居民偏向重油、高盐、高糖饮食习惯。但目前植物源性加工产品出现掺假行为，如不含植物来源的植物蛋白饮料、莲花月饼（实际上是以豆类为原料）、以绿豆为原料制成的栗子甜甜圈等。更有甚者，使用廉价植物源成分冒充高品质、有机食物，以次充好，这些都对我国食品安全监管提出新的挑战，掺假问题会使消费者对食品安全产生质疑。在检测时，通过传统的检测方法很难进行精准检测。要结合全新分子生物学检测方法，对植物种类保守基因以及蛋白质进行检测。作为首要检测手段，需要结合检测对象的基因水平以及蛋白质水平2大内容，对已有的检测技术进行展望。

1 基于聚合酶链式反应的特定基因检测

1.1 常规PCR

聚合酶链反应（PCR）是分子生物学中用于增强特定DNA片段的方法，可以认为是体外生物体DNA的特殊复制，PCR的最大特点是可以增加DNA的量[1]。因此，无论是化石中的古生物学，还是历史人物的遗骸，几十年前的头发、皮肤或血液，只要能提取出一点点DNA，就可以通过PCR增强和比较[2]。这就是“微证明”的力量所在[3]。

常规PCR是在稳定DNA聚合酶作用下，以脱氧核糖核苷酸磷酸作为主要材料，通过引物退火以及DNA双链变性等环节，完全检测到基因信号。适当的培养基，如琼脂糖凝胶，可以准确地确定研究结果。传统PCR使用DNA作为生物遗传信息的载体模板，具有独特的权威性以及科学性[4]。同时，也是检测基因技术应用最广泛的一种方式，具有独特的应用优点。采用常规PCR对序列进行扩增，对青花椒属完成鉴别。在序列号中，青花椒属物种ITS2碱基数分别保持在383、388、385。对食物食用油中的掺假情况进行分析，发掘食用油中加入廉价棕榈油，PCR检测方法的原理：将检测拷贝数限制于5个单倍拷贝体，这种检测技术有较高的灵敏度。例如，若检查的橙汁中柑橘成分，对于橙汁进行PCR检测，能够快速的得知其柑橘成分比例。借助叶绿体基因检测，能够有效分离出原橙汁以及掺假柑橘汁二者之间的比例，该方法的变异系数为7.5%，在盲测中正确识别20样品，以22个样品为最终数。无任何假阳性结果，这得表明常规PCR检测技术有较高的应用优势，但且耗时较长、操作步骤较繁琐。因此，要在后续对常规PCR技术进行升级[5]。

1.2 荧光定量PCR

与传统的PCR检测方法相比，实时荧光定量PCR检测增加了特异性结合基因片段的荧光探针。例如，PCR技术可以增强目标基因的片段，并在单个离心管中分析产物，其特点是具有高特异性、更好的灵敏度、低交叉污染风险的特性。PCR技术检测耗时较小，检测灵敏精准度可达95%以上[6]。对于背景物质的干扰，残留细胞核生破坏程度等均符合要求。对芝麻进行荧光定量PCR检测，能够清晰的对芝麻2s 白蛋白基因进行特异设计。而扁桃仁、腰果、榛子、胡桃、花生、南瓜子、葵花籽等则无交叉反应。硬质小麦以及普通小麦进行掺假分析，检测灵敏度高达0.15，符合最低检测要求。结合运动基因高度保守区域，涉及特异性引物探针，DNA质量浓度的检测精准度达到要求。而对于咖啡豆检测，可连续稀释咖啡溶液，并建立4个物种超标曲线，线性相关系数均达0.99。通过结果显示，这些物种DNA定量检测达0.4，是一种较优的基因检测程序。在检测添加量0.01%~6.00%范围内的肝大豆蛋白，可在加工肉类制品中检测出大豆成分，成为我国新型检测技术。但荧光定量PCI检测对标准曲线有一定的依赖性，在实际样品提取、TCL扩增等方面有一定的差异。因此，限制PCI样品定量分析领域的应用[7]。

1.3 数字PCR

在数字PCR中，注意单分子目的序列。数字PCR拷贝定量技术，能够计算出初始样品的序列，精确拷贝数量，摆脱传统的梯度标准测绘曲线以及基因定量方式，能够对检测样品中的序列号位数量进行确定[8]。数字PCR能够解决传统PCR测量出现的性能复杂、重复性差、带宽低等问题，具有自动化、高带宽的优点。主要数字PCR分为芯片PCR和微滴数字PCR，在食品植物源成分方面，以杏仁露为主，分析杏仁露的掺假成分。数字PCR技术要求检测杏仁露中是否包含花生成分，根据计算公式，在材料质量和拷贝数之间完成特定人工伪造样品和市售样品的检测，重复实验之间的变异系数小于15%，有助于进行定量分析，确定伪造的效果。建立数字PCR定量检测方法，线性拟合系数为0.997 2。因此，数字PCR技术能够精准地显示某销售杏仁露中包含掺假花生成分。数字PCR技术可以显著排除背景干扰影响，提高检测性能。数字PCR技术不会依赖于标准曲线。因此对检测出现的差异性有较高的确认以及应用标准，具有很大的优势。目前，它已成为数字PCR检测技术的主力军，创建一个准确的检测平台，为以后如何识别食品类型和来源成分提出新的研究思路[10]。

2 基于恒温扩增特定基因检测

2.1 环介导等温扩增

环介导等温扩增要结合环介导等温扩增的特定区域，完成引物设置。在恒温条件下（60~65 ℃），采用具有线圈置换活性的聚合酶扩增位于靶区的基因，检测灵敏度高，符合检测标准。与传统PCR技术相比，这种新型检测技术无需精准变温条件，反应时间大、范围缩短、检测结果具有明显的可视化。通过多条引物，对特定区域识别匹配进行反应，有极高的特异性。环介导等温扩增有检测效率较高、操作便捷、对仪器设备要求较低、结果判定简单等优势，已得到广泛应用。对面包混合物进行分析，检测黑芥、白芥检测定量，设置为16 mg·kg-1，定量检测标准定为16 mg·kg-1，采用环介导等温扩增技术，明确分析黑芥、白芥成分。而对于蘑菇样品进行检测，能够对准基因成分以及过敏原检测技术提供DNA片段，突破检测难点。

2.2 重组酶聚合酶扩增

对重聚酶聚合酶扩增进行分析，设计2种以上的特定引物。在25~42 ℃恒温条件下进行检测，了解重组酶催化以及单链DNA结合蛋白定位模板序列，使DNA能够达到聚合酶催化链接。与常规检测方法相比，重组酶聚合酶扩增反应时间更短，在5~15 min内即可完成反应。对于温度也无特定要求，成本较低、反应速度较快、样品预处理要求较低。重组酶聚合酶扩增在一般实验室即可完成检测，限制较低，是近年来食品检测优先使用技术。对芒果肉进行检测，分析芒果肉是否出现掺假，重组酶聚合酶扩增了解芒果肉检测底线为1 copie·uL-1。对于中草药银杏叶是否用刺槐树叶伪造，重组酶聚合酶的扩增具有独特的检测优势，引起了广泛关注。但该技术自身也有一定的缺陷，例如，传统检测方法扩增技术的探针以及引物较短，重组酶聚合酶扩增探针、引物较长，这无疑增加了设计难度。

3 基因序列多态性分析的通用基因检测

在DNA条形码分析中，基因序列多态性分析是一种先进的分析技术，DNA序列的变异性用于快速准确地鉴定物种。DNA条形码现在被认为是一种快速、廉价、通用的物种观察技术，达到有效的监测标准。对橄榄油是否包含菎麻油进行分析，DNA条形码能够精准的检测出橄榄油存在5%的菎麻油掺假成分。原理是通过高分辨溶解曲线，对掺假情况进行检测。对大豆粉进行分析，也可检测大豆粉中存在1%的鹰嘴豆粉。与气相色谱分析法进行对比，DNA条形码分析能够有更好的灵敏度、检测效率。对杏仁、花生、核桃、大豆、芝麻、榛子等检测物进行分析，通过实验表明，部分花生制品加入杏仁。监测依据是花生监测的数据出现波动，该波动表明出现其他物种掺杂。而对蜂蜜进行检测，发现蜂蜜掺杂白糖，且4种草本蜂蜜至少出现2~3种植物成分。

4 结语

在检测中，要求考虑温度、化学物质、紫外线、酸碱度等影响因素，使检测结果更高的稳定性，所有的分析保守因素更为理想。在食品动物植物源性成分检测技术的研究方向，将随着我国检测技术的更新，而不断发生变化。在食品生产、加工过程中，仓储以及对应的加工设备等原因，很有可能导致植物性原分子出现掺杂情况或无意识掺杂等情况。原材料在搅拌、高压、破碎等过程中，必然会出现特征成分纯度下降。检测技术可应用于核酸含量低、高度分解的样本，有目的地完成选型，确保安全。检测技术可以为进一步评估和区分解决方案提供技术依据，快速检测是未来食品生产和周转监管发展的主要趋势。以DPC为代表，将完成精准定量检测目标/以DNA条码技术为发展方向，改变传统检测单一性以及检测数据模糊不精准等问题，实现高效筛选以及多物种分析。