葡萄酒发酵技术及风味物质研究进展

龚钰雯，刘凤听，伍淑婕，罗杨合，康 超

（1. 南宁学院食品与质量工程学院，广西南宁 530200；2. 广西科技大学生物与化学工程学院，广西 柳州 545006；3. 贺州学院 食品与生物工程学院，广西 贺州 542899）

0 引言

葡萄具有种植面积广、品种丰富等特点，富含蛋白质、糖、有机酸等营养物质[1]。葡萄的加工产品是国内外一直研究的热点。我国是最早酿造葡萄酒的国家之一。葡萄酒是用葡萄为原料破碎除梗后压榨成葡萄汁，然后经过发酵制成的酒精饮品。使用葡萄的特点一般为颗粒小、果皮厚、果肉少、多汁且浓缩、葡萄籽占比大、果皮有涩味[2]。随着时代的进步，人们对葡萄酒的风味品质要求越来越高，国外葡萄酒制作工艺成熟、风味丰富，而国内的葡萄酒产品和口味均比较单一，出现产品的同质化现象[3]。因此，我国越来越多的技术都运用在改善和提升葡萄酒口感风味方面。在食品加工过程中，风味物质的添加是改善食品品质和提高食品附加值的重要手段。目前，我国在葡萄酒加工中的风味物质添加主要集中在酯类、醛类和酮类等。主要的风味物质种类可分为呈香物质和呈味物质，呈香物质主要包括萜烯类、挥发酸、挥发酚，呈味物质主要包括糖类、酸类、酚类。发酵是整个葡萄酒制作工艺中最为关键的一步，决定了葡萄酒的色泽、口感和风味。通过介绍葡萄酒的3 种不同的发酵技术，以及葡萄酒的风味物质的种类、作用及影响因素，为今后葡萄酒的口感和风味的研究提供参考。

1 葡萄酒发酵技术

葡萄酒的发酵是多种微生物共同作用的结果，主要由酵母菌、细菌和霉菌三大类所影响，酵母菌中的酿酒酵母是整个发酵过程中的关键。酿酒酵母具有较强的嗜杀性，在酵母细胞内与其他微生物竞争营养，抑制其他微生物的生长。酿酒酵母能产生很多酶，对葡萄中糖分、色素等物质进行分解，是一种能将糖转化为酒精的产酒菌。不同的酿酒酵母种类，所产的酒精含量也不同。酿酒酵母一般会在葡萄汁中繁殖2~3 d，在这个过程中不会将葡萄中原有的糖分完全转化成酒精。抵御外界环境对葡萄酒发酵的影响；能产生硫化氢，其化合物是一种污染性物质，会产生刺鼻气味，对葡萄酒的风味产生不良影响；具有絮凝性，用于葡萄酒的澄清；具有较高的耐受性，能顺利进行酒精发酵[4-5]。随着时代的发展，葡萄酒的发酵技术逐渐变得丰富多样，主要介绍以下3 种发酵技术。

1.1 固定化细胞技术

固定化细胞（Immobilized cell） 通常指采用物理、化学手段锁定在一定载体空间范围内进行生殖代谢的动植物或微生物细胞[6]。固定化细胞技术常用于工业应用，可在冷冻干燥、加工和储存过程中保持细胞活力，并有高操作稳定性、增强细胞活力、提高发酵生产率、细胞控制和细胞回收、应用连续系统配置、提高最终产品质量等优点[7]。其中，在酒精发酵方面，应用固定化细胞发酵可从组织中分离培养出大量的细胞，并对其进行培养、纯化及鉴定，细胞纯度高。而且，细胞制备过程中还可对其进行分离培养，使细胞获得了更多的生长空间和营养物质、促进了其增殖与分化等功能；操作简便，细胞可以根据需要进行包埋或包裹处理；抗杂菌能力增强、增加细胞浓度、提高酒精得率、提高设备利用率等特点[8]。张阳等人[9]将目标蛋白与酿酒酵母细胞壁蛋白融合，酵母表面会形成“真空层”，以此来削弱外界对BGL（β -葡萄糖苷酶） 的抑制作用，从而使葡萄酒的风味更加复杂，香气更加浓郁。Canonicl L 等人[10]用固定化M. pulcherrima菌株与酿酒酵母对比，发现固定后的菌株生产的乙醇含量低于未固定化的1.38%（V/V），并没有出现负面影响，而由于风味物质的增加，葡萄酒的口感更加丰富。但在酒精发酵过程中也存在着某些问题，如固定化载体结垢，是由于酒精发酵中杂质增多，灰分增加，导致结垢；还容易杂菌污染，固定化细胞反复使用，导致酶活力降低，或是细胞载体存在死角，有杂菌存在[11]。虽然固定化细胞技术有一定的缺陷，然而利用固定化细胞技术制得的葡萄酒，除了保留葡萄的果香和营养外，还具有醇厚的酒香味，从而受到很多消费者的喜爱。

1.2 微氧化技术

微氧化技术是法国最早运用在葡萄酒发酵上，在一定条件下，由于氧气与其他氧化剂产生化学反应，进而产生过氧化氢等强氧物种和羟基自由基等强氧化性物质，其反应速度比常规工艺快数倍到几十倍，具体是指将定量的氧气送入高压贮气罐内，通过中间的缓冲池将氧气传送到发酵罐中，其次通过陶瓷扩散器将氧气分散成细小的气泡均匀地扩散到发酵罐中[12]。Dai Lingmin 等人[13]发现，微氧化（Mox） 可维持酿酒酵母群保持在一定的水平，提高酵母再Mox 中的存活时间，可延缓自发MLF 的发生，并提及Mox 的主要目标是加速葡萄酒化学成分的进化，从而提高葡萄酒的品质。氧气的作用是改善酒的色泽，增强酒的风味。有研究通过高剂量氧气处理，发现葡萄酒中色相与蓝黄成分显著升高，同时也增加了锦葵素- 3 - 葡萄糖苷- 乙基黄烷-3 -醇加合物和吡喃花青素的浓度，这些色素比游离花青素更稳定，它们的形成与葡萄酒颜色的稳定有关。其中发酵过程中酚类物质与氧气相互作用，影响葡萄酒的色、香、味。酚类物质在铁离子的作用下转换成醌类，醌类与酚类进一步反应生成大分子褐色沉淀物，从而导致葡萄酒浑浊。花青素在微氧化过程中容易被氧气氧化，使葡萄酒的色泽有所改变。单宁在微氧化过程中同样被氧气氧化，因此消耗了一定的氧气，使花青素尽可能地减少氧化，保护了葡萄酒的颜色，减少苦涩感[14]。目前，国外对微氧化技术的研究比国内偏多，因此国外葡萄酒的发酵技术比国内成熟很多。

1.3 生物工程技术

生物工程技术在古代食品加工中就有运用，现在也是非常重要的加工技术。生物工程技术是20 世纪70 年代末由日本的Horipoka 教授首先提出的，是利用基因技术对生物体进行改造，使其能够生产新的功能基因，从而使其能够产生新的生物产品、药物和化学品等的学科。其是指通过对生物体进行人工干预以产生新的遗传性能，并赋予新功能而进行的一系列技术和工程[15]。生物工程技术主要是发酵工程、基因工程和酶工程这三大类，葡萄酒的发酵主要应用的使发酵工程技术。在葡萄酒苹果酸-乳酸发酵（MLF） 中，主要是利用发酵工程技术，是采用高菌密度的游离细胞能够使MLF 快速启动并且使反应进程容易控制[16]，也是一种利用微生物的特殊功能来生产功能性的产品的技术，如可获得苷酸和氨基酸等营养物质，提高产品的营养价值。王晓勇[17]在堆积发酵与生物工程技术相结合时，汾酒的总酯含量有所提高，并且能优化乙酸乙酯，提升汾酒的风味口感。Gianvito Paola Di等人[18]通过BPCs（应用基础是接种微生物赋予生物保护活性的拮抗机制） 增加总滴定酸度和酯类浓度，降低葡萄酒的pH 值，将VOCs 应用到P.kluyveri酵母时，可观察到葡萄酒的生物控制力受到了抑制，最终得出此拮抗机制对葡萄酒的质量有所贡献。现在，生物工程技术已经被运用在葡萄酒的制作中，但其利用在葡萄酒的发酵方面研究还是较少，这也成为未来研究的难点和热点之一。

2 葡萄酒的风味

葡萄酒风味物质的种类、含量直接影响到葡萄酒的风味口感。近年来，葡萄酒风味物质的研究是一个热点，随着生活质量的提高，爱酒人士对葡萄酒的风味物质需求也逐渐增加，因此风味物质是衡量葡萄酒品质的重要指标，也是影响消费者购买的重要因素，复杂平衡的风味有助于提高市场竞争力[19]。葡萄的风味物质包括主要呈味物质（糖类、酸类、酚类） 和主要呈香物质（萜烯类、挥发酸类、挥发酚类）。

2.1 呈味物质

葡萄酒中主要的呈味物质包括糖类、有机酸类和酚类。糖类是葡萄酒发酵中的重要组分，占比为17%~25%，主要包括葡萄糖、果糖、戊糖、蔗糖和多糖等。其中，葡萄糖和果糖能被酵母菌转换成酒精，是发酵过程中必不可少的糖类。部分糖分可转化成酯和酚酸类等物质，是形成葡萄酒特殊香气的关键化合物，同时也对葡萄酒的风味具有重要的影响。有机酸包括可挥发、不可挥发有机酸，不可挥发有机酸类包括酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、丙酮酸等，占比约为9%，其中苹果酸和酒石酸占总体的90%以上[20]，乳酸、丙酮酸等主要在葡萄酒发酵过程中产生。酒石酸的酸味比较强，常用来提高原料酸度。苹果酸需要乳酸菌进一步将其转化，含量较高时能让葡萄酒拥有酸涩感，使葡萄酒的口感更加细腻[21]。有机酸和糖类对葡萄酒的风味都很重要，有机酸的含量虽然低于糖类，但对葡萄酒的口感品质影响更大。酚类物质是葡萄酒的重要组成之一，对葡萄酒的色泽、口感、风味有一定的影响。酚类物质可分为黄酮类和非黄酮类，非黄酮类在葡萄中主要物质是酚酸，占比20%~25%，以游离形式存在；黄酮类主要有儿茶素、单宁、白藜芦醇、花青素等[22]。因此，酚类物质不仅能够提升葡萄酒的风味，还能够预防癌症、抗氧化等作用，在许多方面都有运用[23]。

2.2 呈香物质

葡萄酒中的呈香物质主要有萜烯类、挥发酸类、挥发酚类。萜烯类主要是以异戊二烯为结构单元构成的烃类化合物，是葡萄酒中重要的营养物质，对身体健康很有好处，不仅可以增强人体免疫力还具有抗菌的作用。其是以糖苷配基形式连接在β - D -葡萄糖上形成单糖苷，再进一步与其他糖键合生成双糖苷或三糖苷，而且其中键合态的糖苷只有转化为游离态的香气成分才能被人的器官所感知[24]。葡萄酒中的挥发酸主要有甲酸、乙酸、丙酸等，其中乙酸是挥发酸的主体部分，约占90%[25]。在葡萄酒发酵过程中，会产生大量的挥发酸，当挥发酸含量过高时会产生异味，从而影响葡萄酒的风味与口感[26]。挥发酚类也是影响葡萄酒风味重要的组成之一。当酚类物质含量较高时，葡萄酒中会产生异味；含量较低时，对葡萄酒风味有促进作用[22]。

3 发酵技术对葡萄酒风味的影响

影响葡萄酒风味的影响因素有很多，如葡萄品种、环境因素（光照、气候、土壤等）、发酵技术、贮藏方式等。发酵技术对葡萄酒的色泽、口感、品质起着决定性的作用，并且不同的发酵技术影响葡萄酒不同的风味。酵母菌在酒精发酵过程中将糖类物质转化产生了酒精、CO2和其他物质，与挥发性物质及非挥发性物质一起形成了葡萄酒特有的风味。

固定化细胞技术通过构建共固定化体系，使多种微生物协调共生，再通过发酵形成丰富的酶系和产物体系，避免了各种菌株因发酵而发生突变，从而提高葡萄酒的风味和质量。有研究表明，将酵母固定在FSS 上，固定化后酵母比普通酵母生产出的酒含有微量的糖和11.12%~11.24% （V/V） 的酒精，有更好的透明度，同时还产生了甲酸和丰富的琥珀酸，和FSS 中含有的乙酸，一起增加了葡萄酒的香气。Carmen B 等人[27]发现，酿酒酵母固定在橡木屑与纤维粉上，会显著影响32 种挥发性物质中的20 种（IOC 18-2007 发酵得到的葡萄酒） 和27 种（55A 发酵得到的葡萄酒） 的浓度；当考虑挥发性化合物家族的总浓度时，固定化酵母中发现更多的酯类和酒精，还有产生的丁酸乙酯、己酸、辛酸、异戊酸和1-丙醇，都能增加葡萄酒香气的复杂性。Anastasios N等人[28]运用酿酒酵母冻干固定化Kefir 培养物，得出了固定化酵母会使发酵时间变短、乙醇生产率为55.3 g /（ld），而且乙醛和乙酸乙酯浓度处于较低水平，增加了葡萄酒的果味特征，使得葡萄酒的气味增加；还在发酵过程中发现了十六酸乙酯（糖果、草药、辛辣气味），辛酸、正癸酸以底气味阈值限值而闻名，会影响到葡萄酒的风味。

微氧化技术中的氧气可以改善葡萄酒的色泽，其中酚类物质与氧气结合生成醌类，乙醇转变为乙醛，它们的产物会使葡萄酒变浑浊，之后生成的乙酸乙酯，也会影响葡萄酒的风味。同时，单宁对葡萄酒中的苦涩感有影响，而在微氧过程中，葡萄酒中单宁容易被氧化，苦涩感下降。Yang Yi 等人[29]发现Mox 用量越大，SO2总浓度下降幅度越大，葡萄酒颜色的发展产生了负面影响；Mox 处理对单宁浓度没有影响，然而在单宁成分方面发现，（-）-表儿茶素延伸单位、没食子酰化和平均单宁聚合度显著升高，但（-）-表儿茶素末端单位和单宁三羟基化显著降低，表明对涩味强度有长期的负面影响。Zhang Z 等人[30]通过Mox 与传统发酵技术进行对比，发现Mox处理后葡萄酒中的总酚、单宁、游离花青素含量低于传统发酵，使其涩味减少，拥有更好的颜色稳定性；但酯类化合物没有受到影响，苯甲醛增加19.9%~228%，双乙酰增加15.6%~95.1%，最终发现Mox 处理会使葡萄酒中的干果味、花香味、坚果味增强，动物味减弱，也能去除绿色气味，从而提高葡萄酒的品质。

生物工程技术中的传统发酵工艺难以控制葡萄酒发酵产物的稳定性，而现代发酵技术会根据发酵过程中发酵产物的含量和酶的活性选择特定的菌株或酶，不仅可以缩短发酵时间，提高发酵效率，还可有效避免细菌污染，保证发酵过程的稳定和安全，并提升葡萄酒的整体风味[31]。Ruiz-Muñoz M等人[32]发现，非酵母菌在纯培养物和基酒，以及仅含有乙醇和甘油作为碳源的培养基中，具有高的乙醇耐受性和生物活性，其中可提高5.5%~7.0%（V/V） 的耐受性，酵母菌株中的β -葡萄糖苷酶活性通过破坏糖苷键从非挥发前体中释放萜烯和其他挥发性化合物，从而提高葡萄酒的风味。

4 结语

虽然葡萄酒的发酵技术种类丰富多样，关于发酵技术的研究越来越多，但完全投入到葡萄酒工厂中的发酵技术仍单一。了解到葡萄酒发酵技术的研究进展，有了新的研究方向：选择不同品种的葡萄原料，提高葡萄酒的品质；通过发酵技术来提升葡萄酒风味和品质的方向；研究不同的发酵技术提高葡萄酒的发酵效率，提升葡萄酒的风味，进一步研究讨论，从而提高葡萄酒的质量和品质。