副溶血性弧菌特异性核酸适配体筛选

李洁 ， 岳晓禹 ， 崔丽伟 ， 许文涛，3 ， 李相阳

1.北京农学院食品科学与工程学院，北京 102206；

2.河南牧业经济学院食品与生物学院，郑州 450046；

3.中国农业大学营养与健康系，北京 100083

副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）是水产品中常见的食源性致病菌，根据报道，其已超过沙门氏菌成为造成细菌性中毒最主要的微生物［1-2］。副溶血性弧菌属于革兰氏阴性菌，作为中等嗜盐菌，其在1%～9% NaCl 溶液中均可以生长繁殖，最佳生长浓度约为3% NaCl，最佳生长温度30～35℃，低于4℃时停止生长，因此在温暖的海水中优先生长。根据菌体O 型抗原和荚膜K 型抗原的不同，副溶血性弧菌可以分为13种O型和71种K型［3-4］。副溶血性弧菌的爆发不仅会使大量的水产动物快速死亡，造成严重的经济损失，还会使消费者因食用被污染的水产品而引起流行性腹泻，危害消费者的身体健康［5-7］。因此，针对副溶血性弧菌筛选核酸适配体对于其快检技术的开发具有重要的意义。

核酸适配体是目前备受关注的一种识别元件，通过其特异性识别可以将靶标浓度归一化为核酸分子，并进一步与不同的信号输出方式结合实现快速检测［8-10］。核酸适配体是通过指数富集配体系统进化技术（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）获得的一段寡核苷酸序列，可以特异性的识别靶标物质［11］。1990 年首次被开发，此后的三十多年中多种靶标物质的适配体陆续被开发和应用，包括农药、重金属、抗生素和微生物等［12-13］。

本研究利用cell-SELEX技术对副溶血性弧菌的适配体进行了筛选，并对每轮筛选中的PCR 轮数和Lambda外切酶使用量进行了优化，以期为副溶血性弧菌的快速检测奠定基础。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1实验菌种 实验使用的副溶血性弧菌ATCC 17802、单增李斯特氏菌CMCC 54002、金黄色葡萄球菌ATCC 29213 和鼠伤寒沙门氏菌CMCC 50115 由中国农业大学农业部农业转基因生物安全评估（食品）重点实验室提供。

1.1.2实验试剂 rTaq酶、dNTP、100 bp DNA Marker 和核酸染料购自北京天根生化科技有限公司；西班牙琼脂糖购自北京沃比森科技有限公司；qPCR Mix购自北京全式金生物科技有限公司；3%氯化钠碱性蛋白胨水购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，其余试剂均为国产分析纯。

1.1.3试剂配制 1×BB 缓冲溶液：称取1.212 g Tris、0.175 4 g NaCl、0.203 3 g MgCl2·6H2O 溶于150 mL去离子水中，调至pH 7.5，加入去离子水补足至200 mL。

适配体处理：将合成的适配体粉末于4 ℃ 4 000 r·min-1离心2 min 后加入一定量的超纯水得到100 μmol·L-1母液，置于-20 ℃储存。每次使用前将100 μmol·L-1母液稀释成相应的浓度，置于95 ℃、金属浴中10 min，冰上立即冷却10 min以获得变性的核酸适配体，便于适配体与靶标的后续结合。

1.1.4实验仪器 LineGene 9600plus 荧光定量PCR 检测仪购自杭州博日科技有限公司；A300 基因扩增仪购自杭州朗基科学仪器有限公司；电泳仪购自北京市六一仪器厂；凝胶成像仪购自上海勤翔科学仪器有限公司；流式细胞仪购自贝克曼库尔特有限公司；可调式混匀仪旋涡混合器购自北京开源国创科技有限公司；气浴恒温振荡仪购自北京得利特科技有限公司；恒温金属浴购自北京富德安科技有限公司；CF1524R 台式高速冷冻离心机购自杭州恒流科技有限公司；Nanodrop 超微量分光光度计购自赛默飞世尔科技公司。

1.2 实验方法

1.2.1副溶血性弧菌生长曲线测定 取活化好的菌液1 mL 加入含30 mL 3%氯化钠碱性蛋白胨水液体培养基的50 mL 锥形瓶中，37 ℃ 200 r·min-1下培养。每隔1 h 测量一次OD620，绘制生长曲线以确定菌生长的对数期。选取合适培养时间的菌液进行平板计数。

1.2.2引物退火温度优化 初始文库由35 个碱基的核心区域和两端各20 个碱基的引物区域组成，即5'-ATCCATTGCCACTGACTACC-N10-AGGTTAAGAGGCGCT-N10-GAAGTCAGTCGGTCGTTAGT-3'，用于PCR 扩增的引物分别为上游引物5'-ATCCATTGCCACTGACTACC-3' ，下游引物5'-ACTAACGACCGACTGACTTC-3'，其中下游引物的5'端磷酸化修饰用于单链制备。在实验开始前将引物在55～65 ℃之间进行退火温度的优化，扩增后利用4%琼脂糖凝胶电泳进行结果验证。

1.2.3适配体筛选过程 本筛选过程一共为12 轮，包括9 轮正向筛选和3 轮反向筛选，在反向筛选中选择国标中与副溶血性弧菌出现在同一食品中的微生物作为负筛靶标，包括金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和单增李斯特菌，负筛靶标的使用可以提高筛选到的适配体特异性。具体筛选中使用的各组分加样量如表1 所示，在12 轮的筛选中逐渐减小菌液加样量、减短孵育时间及增加孵育后洗涤次数以增加筛选压力。双链的大量扩增使用PCR 方法，单链获得采用Lambda 酶切方法，在每轮扩增中对PCR轮数和Lambda外切酶用量进行优化。次级文库纯化使用醇沉法。12 轮筛选完成后送测序公司进行序列测序并对得到的序列进行性能探究，亲和力则利用Saika等［15］报道的方法进行计算。

表1 筛选过程中各组分加样量及反应时间Table 1 Sample loading and reaction time of each component in the SELEX

2 结果与分析

2.1 副溶血性弧菌生长曲线

在接菌完成后每小时测量一次OD620以对副溶血性弧菌生长的对数期进行探究。由图1可知，经过1 h 延滞期副溶血性弧菌进入快速生长阶段，选择培养5 h 的菌液进行平板计数得到此时菌落总数约为109CFU·mL-1，适合用于适配体筛选，因此选用5 h 作为后续菌液的培养时间。

图1 副溶血性弧菌的生长曲线Fig. 1 Growth curve of Vibrio parahaemolyticus

2.2 引物退火温度优化

合适的退火温度有利于质量更高的PCR产物产生［16］。在55～65 ℃之间进行退火温度优化，由图2 可知，随着退火温度的不断升高非特异性产物条带（图2 中75 bp 产物以外部分）越来越明亮，因此选择55 ℃作为后续实验的退火温度。

图2 退火温度优化结果Fig. 2 Results of annealing temperature optimization

2.3 适配体筛选

随着筛选中PCR 扩增产生的偏差和Lambda外切酶在单链生产中发生的切割偏差，PCR 过程中会产生非特异性产物，因此每轮扩增中需对PCR轮数进行优化，以第4轮筛选的PCR优化为例，随着扩增轮数的增加，非特异性产物越来越多，如果扩增轮数过少则不能产生足够的目标产物，因此，在第4 轮中选择28 轮作为扩增轮数（图3）。PCR 产物的不同则需要不同的Lambda 外切酶用量，酶切时间过长和酶量使用过多都会造成目标序列的损失，而酶切时间过短和酶量使用过少则会导致目标单链的产量不足，难以有效构建次级文库。以第3轮筛选的酶切优化为例，在45 μL双链产物中加入0.8、1.0、1.2、1.5和2 μL Lambda外切酶和5 μL缓冲液，结果如图4 所示，0.8 μL 产生的单链最多。

图3 第4轮筛选PCR轮数优化结果Fig. 3 Results of PCR cycle optimization in fourth round of SELEX

图4 第3轮筛选Lambda外酶切优化结果Fig. 4 Results of Lambda exonuclease enzyme optimization in third round of SELEX

经过12轮的筛选后进行测序及同源性分析，从中初选了10条序列进行qPCR，当适配体与靶标菌具有较好的结合效果时，同样的菌数可以结合更多的适配体数量，因此产生更小的Ct值，由图5可知，F-3-2和F-28-10在10条序列中更好的结合效果。

图5 10条候选适配体序列的qPCR结果Fig. 5 Results of qPCR for 10 candidate aptamer sequences

利用流式细胞术对这2 条序列进行适配体结合效果和特异性的进一步探索。如图6所示，2条适配体均表现了较好的特异性，其中F-28-10特异性表现更佳。由图7 阴性菌和适配体孵育后的菌体荧光对比可知，2 条适配体均具有较好的结合能力且F-28-10 表现更佳。因此，F-28-10 为筛选得到的效果最佳的适配体，序列为5'-ATCCATT GCCACTGACTACCAATATCACGTAGGTTAAGAGGC GCTCTCCCACCAAGAAGTCAGTCGGTCGTTAGT-3'。

图6 适配体与细菌结合的流式细胞术分析Fig. 6 Flow cytometric analysis of aptamers binding to bacteria

图7 适配体F-3-2和F-28-10结合效果对比Fig. 7 Comparison of binding effects of aptamers F-3-2 and F-28-10

进一步对F-28-10 的亲和力进行研究，适配体浓度按100～10-4nmol·L-1梯度对F-28-10 做标准曲线（图8），获得了用于适配体结合浓度计算的回归方程y=（8.89±0.30）-（3.73±0.14）x（R2=0.995）。固定副溶血性弧菌浓度，增加适配体浓度获得适配体-靶标解离饱和曲线。将1、10、50、100、200 nmol·L-1浓度的适配体序列与靶标孵育，qPCR 后计算结合浓度获得了解离饱和曲线（图9）。Kd值越低证明适配体与靶标结合越好，利用Origin 软件拟合得到F-28-10 的Kd值为44.31±31.46 nmol·L-1。

图8 适配体F-28-10的亲和力研究Fig. 8 Affinity study of aptamer F-28-10

图9 F-28-10与副溶血性弧菌的结合解离曲线Fig. 9 Dissociation saturation curves of F-28-10 and Vibrio parahaemolyticus

3 讨论

自1950 年首次在日本被发现，副溶血性弧菌就成为了全球性的卫生安全问题，并随着我国居民生活水平提升和水产品消费量的不断增长成为我国细菌性中毒事件发生的首要原因。在合适的条件下副溶血性弧菌将在3～4 h 内快速生长［17］，因此用于副溶血性弧菌检测的适配体传感器的开发近年来受到广泛关注［18-19］，然而相比于大肠杆菌等其他常见食源性致病菌，副溶血性弧菌适配体筛选的数量较少，因此本研究通过在12 轮的筛选中逐渐增加筛选压力，并对每轮PCR 扩增轮数和Lambda外切酶用量进行优化，同时在测序后通过qPCR 和流式细胞术技术验证分析得到了一条在特异性和结合能力方面表现最佳的适配体序列F-28-10，研究结果丰富了副溶血性弧菌在适配体传感器开发中识别元件的选择。