中药材组培脱毒技术研究进展

高文敬，董景湘，刘灵娣*

（1.河北省农林科学院经济作物研究所/河北省药用植物工程技术研究中心，河北 石家庄 050051；2.河北省农林科学院，河北 石家庄 050051）

中药材为具有道地性和中国特色的原生药材，是药用植物产业发展的基础，其种类繁多，开发潜力大，蕴藏量较为丰富，在长期发展和使用中获得了医生和患者的高度认可[1]。随着医药学和农业的发展以及新冠疫情的出现，人们对中药材的重视程度加大，中药材市场需求量越来越大，导致大量中药材野生资源被过度采挖，其野生环境遭到严重破坏，蕴藏量急剧下降。近年来，为解决中药材市场需求和资源供应不足等问题，中药材种植业得到了快速发展，但在种植过程中由于植物病毒在其体内不断积累，致使中药材产量和品质受到严重影响，甚至造成绝产和种质退化等多种问题[2]。而目前，中药材病毒病还没有行之有效的办法根治。为了更好地保护、开发和利用中药材种质资源，利用组织培养的方式培养脱毒苗是有效控制和消除中药材病毒病的关键所在，也是中药材达到商品化、产业化、标准化、规范化生产需要解决的首要问题。现已有报道的中药材脱毒方法多种多样，主要包括热处理、茎尖组培、热处理+茎尖组培脱毒、化学法、物理法、基因编辑法等。对近年来中药材组织培养脱毒技术研究进展进行系统综述，以期为中药材组培脱毒技术的更深入研究提供参考。

1 中药材常见病毒病的种类

中药材种类繁多，其病毒种类也多种多样，中药材感染的病毒主要包括黄瓜花叶病毒（CMV）、烟草花叶病毒（TMV）、大蒜潜隐病毒（GLV）、韭葱黄条病毒（LYSV）、马铃薯A 病毒（PVA）、马铃薯M 病毒 （PVM）、马铃薯 S 病毒 （PVS）、马铃薯 Y 病（PVY）、百合无症病毒 （LSV） 和番茄不孕病毒（TAV）等[3]。不同中药材病毒病的研究程度不一致，有些中药材会遭到多种病毒侵染，并具有传播迅速、病症复杂、病毒在植株内分布不均、初侵染与再侵染特征不一致等特点[4]。综合来看，前人对出现花叶、皱叶、条纹、斑驳、坏死、畸形等表型明显的病毒研究较多，对表型不明显的病毒研究较少。

2 中药材组培脱毒技术研究现状

2.1 热处理脱毒技术

植物脱毒技术是近几十年来才逐渐发展起来的，热处理脱毒是最早应用的一种脱毒方法，解决了部分病毒病害造成的减产问题[5]。热处理是利用某些病毒较寄主植物对温度敏感、对高温忍耐度较差的特性，通过高温处理，使病毒失活发生钝化，病毒的繁殖和扩散速度得到控制的一种处理方式。经较长时间高温处理后，由于寄主植物的生长速度快于病毒的传播速度，因此病毒含量会慢慢减少，随后将生长较快、不含病毒的组织切取后进行组织培养，最终可得到脱毒苗。世界上已知脱除病毒最早的例子是用热处理脱除马铃薯卷叶病毒（PLVR）[6]。早在1889 年印度尼西亚爪吐人就用50 ℃左右的热水浸泡用于繁殖的甘蔗茎段来防止病毒病的发生，现在许多国家在种植甘蔗前仍使用这种处理方法[5]。热处理技术也被广泛应用到各种中药材的脱毒过程中。一般采用35～55 ℃的热水或高温蒸汽、高温空气，根据外界温度和外植体的不同决定热处理的时长[7]。吴群英等[8]对罗汉果组培苗进行38.5 ℃高温处理10 d，得到了完全脱毒的罗汉果健康种苗。肖颖等[9]分别在 20、25、30、35、40、45 ℃高温条件下对息半夏组培苗进行脱毒处理，利用显微镜检测法检测脱毒情况，结果显示，在一定温度范围内，脱毒率随着温度的升高而明显提高。随着研究的深入和技术的不断进步，目前常采用热处理与其他脱毒技术相结合的方法对中药材进行脱毒。

2.2 茎尖培养脱毒技术

病毒在植株体内的分布并不均匀，其中茎尖分生组织生长较快且无维管束，病毒感染程度较低，茎尖生长点区域几乎没有病毒[10]。茎尖培养脱毒技术最早是1952 年法国学者Morel 等[11]在大丽菊上应用成功；之后，随着植物组培技术的进步和完善，该方法得到了广泛应用，目前在中药材上已经应用于贡菊、滁菊、地黄、太子参、丹参、半夏等的脱毒，并获得了脱毒组培苗[12，13]。茎尖脱毒既能够在很大程度上保持遗传性状的稳定，又能够脱除一些具有潜在威胁的真菌和细菌，因此深受研究人员的重视。茎尖脱毒技术的重点是切取茎尖的大小和培养基的筛选。茎尖太小会大大降低成活率，茎尖太大则会影响脱毒效果，研究表明，切取长0.2～0.5 mm 的茎尖进行培养既可以保证一定的成活率，又可以最大程度地提高脱毒效率[14～16]。在马铃薯上，切取长0.2 mm 左右的茎尖进行培养，成活率和脱毒率分别达到68%和56%[14]。在百合上，剥取长0.2～0.5 mm 的茎尖分生组织进行培养，脱毒效果和成活率均较好[15，16]。王宝霞等[17]对半夏茎尖愈伤组织诱导的培养基进行了优化，确定最佳培养基为 MS+6-BA 1.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L+琼脂 7 g/L+蔗糖30 g/L，并可一次性成苗，经检测TMV、CMV 和SMV 脱毒率均达到100%。张淑娟等[18]筛选出唐菖蒲茎尖丛生芽的最佳诱导培养基为6-BA 0.5～2 mg/L+NAA 0.05～0.2 mg/L，丛生芽增殖初期效果最好的培养基为 2/3MS+6-BA 1.0～1.5 mg/L+NAA 0.10～0.15 mg/L，最佳生根培养基为1/2MS+NAA 0.3 mg/L，经检测，供试的5 个品种均不带菜豆黄花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草环斑病毒和蚕豆萎蔫病毒。

2.3 热处理＋茎尖培养脱毒技术

采用茎尖脱毒培养技术，通常需切取非常短的茎尖，且还需在显微镜下进行，因此实际操作起来费时费力，且脱毒效果也不特别理想。研究发现，将热处理与茎尖脱毒培养结合起来，可使脱毒率得到一定幅度的提升[5]。曹有龙等[19]切取枸杞茎尖置于38 ℃高温环境培养28～30 d，之后转入生根培养基中培养，恢复生长后得到组培苗，移栽后经检测均未携带病毒，采用热处理+茎尖培养脱毒技术在很大程度上提升了脱毒效果。江洪如等[20]将外植体置于温箱中先58 ℃处理10～20 min，再 38 ℃处理 72 h 后，切取长 0.2～0.4 mm的茎尖进行培养，可获得完全脱去4 种主要病毒的百合脱毒苗。湿春秀等[21]以3 个种类的丹参为试材，将其试管苗置于光照培养箱中37～38 ℃恒温培养38 d后，利用双目体视显微镜在无菌条件下切取长0.2～0.4 mm的茎尖，随后放到配制好的培养基上进行培养，最后得到组培苗，检测结果显示，3 个种类的丹参均已脱除CMV 病毒；但不同类型丹参的脱除率存在较大差异，其中皱叶丹参脱毒率高达80%，大叶丹参脱毒率为40%，而狭叶丹参脱毒率仅为20%。说明在不同种类的中药材上，热处理+茎尖培养脱毒技术的使用效果不同，需要进一步探索其他方法。外植体的成活率直接影响脱毒效率，随着热处理时间的延长，成活率逐渐降低。近几年，很多研究人员倾向于利用变温处理与茎尖脱毒培养相结合的方式进行脱毒处理。顾沛雯[22]研究发现，脱毒过程中采用热处理与茎尖培养相结合的方法可使葡萄组培苗的成活率和脱毒率均较单纯茎尖培养有所提高，其中，白天38 ℃/夜晚32 ℃变温处理的成活率较38 ℃恒温处理提高15.6%，而脱毒率无明显差别。石贵玉等[23]在毛葡萄上进行了组培脱毒技术研究，发现白天37 ℃时长8 h/夜晚22 ℃时长16 h 处理10～15 d，茎尖成活率可达80%以上，脱毒率高达100%。

2.4 愈伤组织诱导脱毒技术

愈伤组织诱导脱病毒技术是通过对植株或部分组织进行培养，诱导产生愈伤组织，分化出芽后形成植株，经病毒检测筛选出无毒苗的方法。该方法可行性强，适用于实验室研究，具有周期较短、一次性成苗数量多等优点，已经在很多中药材脱毒中应用。愈伤组织诱导通常选择嫩叶、花药、株芽、茎尖等作为外植体。谢红娥等[24]对半夏叶片、叶柄、株芽进行消毒处理后置于附加不同外源激素的培养基中进行愈伤组织诱导，发现6-BA 2.0 mg/L 附加适量的NAA、GA3对珠芽增殖有促进作用，还可促进试管苗的生长速度；IAA 0.2～0.5 mg/L 可促进半夏根系生长；6-BA 2.0 mg/L、GA30.2 mg/L 配合适当浓度的2，4-D 和NAA，可促进半夏叶片愈伤形成，促使其直接长出根和叶片；利用6-BA 1.0～2.0 mg/L、NAA 0.2 mg/L 可诱导茎尖一次性成苗，病毒脱除率达到80%。彭向前等[25]对半夏株芽进行处理，筛选出适宜半夏脱毒苗繁殖的培养基，结果显示，在MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.1 mg/L+KT 0.10 mg/L 培养基中诱导效果较好，脱毒率可达100%。王宝霞等[17]成功建立了能够一次性成苗的再生体系，可以快速、高效地通过茎尖诱导半夏无毒苗，筛选出最佳诱导培养基为MS+6-BA 1.5 mg/L+2，4-D 2.0 mg/L+琼脂7 g/L+蔗糖30 g/L，并可一次性成苗，经检测TMV、CMV 和SMV 脱毒率均达到100%。

2.5 超低温保存脱毒技术

长期以来，超低温技术用于大多数植物种质资源的保存。近几年，研究人员发现超低温可以杀死病毒，超低温脱毒技术逐渐发展和应用到植物脱毒中来，并成为一项对多种植物病毒脱除效率较高的理想方法。其具体操作方法是将植物试材在超低温保护剂的保护下放入-196 ℃的液氮中处理，然后再解冻，通过组培的方法使其分化成完整植株[26]。超低温脱毒的最佳试材是植株茎尖顶端分生组织，其细胞体积小、含水量较低，抗低温能力较强，可以在低温条件下存活，进而达到脱除病毒的效果。试材经超低温处理后，即使切取较大的茎尖，也能确保形成的再生植株为脱毒苗。该技术操作较为容易，且节省成本，脱毒苗成苗速度更快。Brison 等[27]采用超低温脱毒的方法首次成功脱去了李树痘病毒（PPV），脱毒率达到50%，较传统茎尖脱毒技术获得的无菌苗脱毒率提升了30%。Wang 等[28，29]采用超低温法去除了葡萄病毒A（GVA）、马铃薯Y 病毒（PVY） 和马铃薯卷叶病毒（PLRV），脱毒率较高，其中对GVA 的脱毒率达到了97%，明显高于传统的茎尖脱毒技术的脱毒率（仅12%）。白建明等[26]分别采用超低温保存法和3 种常规方法（茎尖分生组织培养、热处理、热处理+茎尖分生组织培养）对马铃薯试管苗的马铃薯纺锤块茎类病毒（PSTVd）和马铃薯X 病毒（PVX）进行脱毒，结果表明，马铃薯茎尖经超低温保存后存活率和成苗率均高于常规方法处理。靳慧洁[30]通过超低温脱毒+茎尖培养相结合的方法成功获得了百合脱毒苗。戴军等[31]将太子参超低温处理1 h，在适宜生长发育的条件下培养，可使脱毒率达到90%，生产的脱毒苗可以满足规模化种植需求。有研究发现，超低温脱毒还可以脱除一些传统脱毒方法不能脱除的病毒。

2.6 其他脱毒技术

除以上脱毒技术外，还有很多其他方法应用到中药材的脱毒中来，如花药和花粉培养、珠胚心培养、茎尖微嫁接技术、病毒抑制剂处理以及多种方法结合的形式，但由于中药材种类繁多，因此不同种类、不同品种甚至不同株系的脱毒效果存在较大差异。

综合来看，在中药材脱病毒研究中，热处理+茎尖培养脱病毒技术最成熟，使用最多；超低温脱毒技术脱毒效果最好，但应用和报道较少，还需要进一步探索，该方法具有非常广阔的应用前景。

3 病毒检测技术

通过各种脱毒技术获得的脱毒苗要想在生产中推广，还需要经过严格的检测，确定植株脱毒成功后才能应用。目前常用的病毒检测方法仍以传统方法为主，主要包括酶联免疫吸附法（ELISA）、电镜检测和指示植物法。

ELISA 法是目前应用最多的病毒检测方法，通过抗原与抗体免疫反应利用酶的高效催化反应进行测定，具灵敏度较高、测定迅速、能同时测定多个样品的特点，但植物病毒抗原性较差，可能会发生假阳性反应，在一定程度上造成检测结果不准确[3]。

RT-PCR 检测方法是指通过体外快速扩增特定基因或DNA 序列进行结构和功能分析的方法。该方法灵敏性很高、结果精确，还可与其他检测方法搭配使用，广泛应用于各个学科。

电镜检测是一种非常重要的病毒检测手段，通过观察病毒的形态、大小和组织结构，确定脱毒苗是否完全脱毒。该方法对技术和仪器要求很高，所需显微镜非常昂贵，因此未得到广泛推广。

指示植物法是病毒检测中应用较早的一种方法，其原理是指示植物对某些病毒很敏感，叶片受到病毒侵染后会产生明显的症状。操作上一般是蘸取待测植株汁液摩擦指示植物的叶片，观察一段时间后看是否出现明显的病症。该方法操作简单、方便观察，但症状显示速度慢，观察周期长，受季节和环境变化影响大，因此无法广泛应用。

4 问题与展望

随着科学技术的发展，组培脱毒技术在多种作物上得到应用，经过组培脱毒得到的脱毒苗也逐渐在规模化、商业化生产中应用，提升了作物产量和品质，脱毒技术研究和应用逐步从单一脱毒方法向2 种或多种方法相结合发展，不断提高了成活率和脱毒率。由于中药材研究起步较晚，研究经费和经验不足，目前可应用到规模化、商业化生产中的中药材脱毒苗较少，且脱毒技术还需要进一步研究。

目前中药材研究中较为成熟的脱毒技术是热处理+茎尖培养脱毒，虽然应用广泛，且取得了较好效果，但还有较大的提升空间。另外，超低温脱毒技术较传统脱毒技术效率高、脱毒效果好，是一个非常具有应用前景和研究价值的技术，但目前在中药材脱毒上还未得到充分应用。以往中药材脱毒研究内容大多集中在脱毒技术和培养条件的优化上，对病毒检测方法的研究较少，而现有的检测方法尚存在一些不足和弊端，如需要多种检测方式反复检测最终才能得到确切结果，费时费力，因此，发展和优化病毒检测方法是今后研究的一个重要方向。通过现有技术和农作物成功经验，加大中药材脱毒研究投入，不断优化和发展脱毒技术和检测方法仍然是提高成活率和脱毒率，实现脱毒苗商业化种植应用的重点。将基础研究成果早日应用到实际生产中，加速成果转化进程，实现产业化、规模化、商业化应用和推广，促进中药材产业的发展。