血管生成素4 对牙髓干细胞成牙本质向分化的作用

范心怡，刘苍维，周怡君，任飞龙，史册，孙宏晨

1.吉林大学口腔医院病理科，吉林 长春（130021）；2.吉林省牙发育及颌骨重塑与再生重点实验室，吉林 长春（130021）；3.中国医科大学附属口腔医院口腔病理科，辽宁 沈阳（110001）

人牙髓干细胞（human dental pulp stem cells,hDPSCs）是一种颅神经嵴来源的间充质干细胞，通常位于成牙本质细胞层的内侧和牙髓血管系统周围，在牙本质受损时可以分化为成牙本质细胞形成牙本质［1］。体内研究表明，将hDPSCs 聚集体充填于人牙根管，移植到免疫缺陷小鼠皮下，hDPSCs能够分化为成牙本质细胞样细胞，形成牙髓-牙本质样结构［2］。体外实验表明，hDPSCs 在不同种信号分子和生长因子的诱导下，可以分化为多种细胞，如成牙本质细胞样细胞、软骨细胞和神经元等［3-4］。这些发现使hDPSCs 成为组织再生和细胞治疗的良好候选者，然而生长因子及其受体途径与hDPSCs 分化之间的信号网络尚未完全阐明。识别能够促进牙髓干细胞成牙本质向分化的生长因子可为牙本质再生的研究提供新靶点［5］。

血管生成素4（angiopoietin 4，ANGPT4），是内皮细胞特异性受体酪氨酸激酶TIE2 的配体［6］。血管生成素及其受体间的信号转导是影响细胞活性和胚胎干细胞分化的关键机制。有研究报道，血管生成素1（angiopoietin 1，ANGPT1）重组蛋白可促进间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）向软骨细胞和成骨细胞分化［7］，体内利用可吸收胶原海绵作为载体植入ANGPT1 重组蛋白可促进颅骨缺损的骨修复与再生［8］。ANGPT4 作为血管生成素家族成员，具有与ANGPT1 相似的功能，能够通过TIE2 途径诱导体内血管形成，并且具有调节血管重塑和成熟的功能［9］。在牙髓中，血管生成为成牙本质细胞提供氧气、磷酸盐和成牙本质细胞因子，以支持其成熟和成牙本质发生［10］。本实验旨在探讨ANGPT4 对hDPSCs 成牙本质向分化的影响。

1 材料和方法

本研究通过中国医科大学口腔医学院伦理委员会审查批准，批号：中国医科大学附属口腔医院（2019）科伦审字（K2019037）号。

1.1 试剂与仪器

多聚甲醛（天津光复，中国）；快速脱钙液（0500-0052，北 京 卓 鼎，中 国）；Anti-ANGPT4（MAB964，R&D，美国）；Anti-β-actin（66009-1，Proteintech，美国），Alexa-594 标记山羊抗小鼠二抗（66009-1，Proteintech，美国）；DAPI（C0060，索莱宝，中国）；Ⅰ型胶原酶（LSOO4196，Worthington，美国）；Dispase Ⅱ酶（D4693，Sigma，美国）；胎牛血清（FB15015，Clark，美国）；高糖培养基（8122377，Gibco，美国）；Anti-Human CD90（Invitrogen，美国）；Anti-Human CD105（Invitrogen，美国）；Anti-Human CD34（Proteintech，美国）；Anti-Human CD45（Biolegend，美国）；HifairⅡ1stStrand cDNA Synthesis Super-Mix For qPCR 试剂盒（翊圣，中国）；Hieff qPCR SYBR Green Master Mix 试剂盒（翊圣，中国）；BCA蛋白检测试剂盒（碧云天，中国）；PVDF 膜（Millipore，美国）；山羊抗兔二抗（SA00001-2，Proteintech，美国）；山羊抗小鼠二抗（SA00001-1，Proteintech，美国）；ALP 染液（Sigma，美国）；茜素红S 染液（索莱宝，中国）。激光共聚焦显微镜（OLS4000，Olympus，日本）；CO2恒温培养箱（Phcbi，日本）；倒置相差显微镜（BX53，Olympus，日本）；流式细胞仪（MACSQaunt VYB，Miltenyi，德国）。

1.2 HE 和免疫荧光染色

在获得患者知情同意后，收集临床年龄在18 ～25 周岁患者因正畸拔除的前磨牙。人健康前磨牙拔除后立即在4%多聚甲醛中固定24 h，然后在快速脱钙液中脱钙4 ～5 周，经脱水，透明，石蜡包埋后，行5 μm 连续切片。每组选取3 张石蜡切片，经过脱蜡水化后行HE 或免疫荧光染色。HE 染色：切片用苏木精染液染色1 ～2 min 后进行分化和返蓝，再用伊红染液染色10 ～30 s。切片染色后用流动水冲洗2 min，最后进行脱水，透明和封片。免疫荧光染色：切片用胃酶修复液在37 ℃下修复10 min。修复后在每张切片上滴加50 μL 浓度为2%的牛血清白蛋白封闭液，室温封闭1 h。然后在每张切片上滴加50 μL Anti-ANGPT4（1∶100）一抗，4 ℃条件下孵育过夜。次日，在每张切片上滴加50 μL Alexa-594 标记的山羊抗小鼠二抗（1∶200），室温避光孵育1 h。用DAPI 进行核染色，并用抗淬灭封片剂封片。使用共聚焦激光扫描显微镜成像。

1.3 hDPSCs 的分离培养与鉴定

牙拔除后用酒精棉球擦拭3～4 次，然后敲开牙釉质和牙本质，暴露牙髓。将牙髓组织从髓室和根管中轻轻分离，将牙髓组织剪成0.5 mm ×0.5 mm × 0.5 mm 大小的组织碎片。加入200 μL 6 mg/mL Ⅰ型胶原酶和200 μL 8 mg/mL Dispase Ⅱ酶溶液，置于CO2恒温培养箱中消化30 ～60 min。终止消化后转移至细胞培养瓶中培养，即为hDPSCs。根据细胞生长状态定期更换培养基。倒置显微镜下观察hDPSCs 生长状况，当细胞密度达到80%融合时，进行细胞传代。后续选择第3 代hDPSCs 用于实验。

1.3.1 细胞表面标记物鉴定 hDPSCs 培养至80%融合，弃除培养基后，PBS 洗3 次。经消化、离心后，用流式染色缓冲液（FACS buffer）重悬至细胞浓度为1 × 107个/mL。每组取100 μL 细胞重悬液，分别加入Anti-Human CD90、Anti-Human CD105、Anti-Human CD34 和Anti-Human CD45 的抗体，4 ℃避光孵育30 min。抗体孵育后用FACS buffer 清洗3 次，400 g 离心3 min。离心后重悬于100 μL FACS buffer 中。检测前，细胞通过70 μm 孔径的细胞过滤器过滤，去除细胞团。使用流式细胞仪检测细胞表面标记物CD90、CD105、CD34 和CD45 的表达。

1.3.2 多向分化能力鉴定 取生长状态良好的hDPSCs，经消化、离心、重悬后，接种到12 孔板或24 孔板，置于CO2恒温培养箱中培养，当细胞融合至80%时，更换为成牙本质向分化诱导培养基或成脂向分化诱导培养基。成牙本质向诱导7 d 后进行碱性磷酸酶染色，14 d 后进行茜素红S 染色；成脂向诱导30 d 进行油红O 染色。

1.4 RT-qPCR

Trizol 法提取细胞总RNA，室温干燥后用DEPC水溶解。利用Nanodrop 软件测RNA 浓度。使用HifairⅡ1st Strand cDNA Synthesis SuperMix For qPCR 试剂盒进行逆转录。用Hieff qPCR SYBR Green Master Mix 试剂盒行RT-qPCR。以ACTB 为内参检测ANGPT4 以及成牙本质细胞标记物Runt相关转录因子2（Runt-related transcription factor 2，Runx2）、牙本质基质蛋白1（dentin matrix protein 1，DMP1）和牙本质涎磷蛋白（dentin sialophosphoprotein，DSPP）基因的相对表达量。引物序列见表1，引物由生工生物技术有限公司（上海，中国）合成。目的基因Ct 值与内参基因比较，采用2-△△Ct方法计算。

表1 RT-qPCR 引物序列Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

1.5 在hDPSCs 中沉默ANGPT4

用载有si-ANGPT4（终浓度为75 pmol/mL）的转染复合物瞬时转染hDPSCs 以沉默ANGPT4 的表达，以转染Scrambled siRNA 为阴性对照。hDPSCs以2 × 104个/cm2接种到24 孔板或12 孔板，接板后置于CO2恒温培养箱中，培养24 h 后，细胞融合至80%左右，开始转染siRNA。将转染试剂GP-transfect-Mate 与siRNA 混 合 后 转 染 细 胞，孵 育4 h 后 换成正常培养基。利用荧光标记的FAM siRNA 评估转染效率。siRNA 序列见表2。

表2 siRNA 序列Table 2 siRNA sequences

1.6 Western blot

细胞用PBS 冲洗后，加RIPA 缓冲液裂解细胞获取总蛋白。使用BCA 蛋白检测试剂盒测定蛋白浓度。蛋白变性后将等量蛋白质（20 μg）加入10%聚丙烯酰胺凝胶中，进行电泳分离。然后转移到PVDF 膜上。转膜后用10%脱脂牛奶封闭1 h，随后4 ℃条件下一抗孵育过夜。一抗如下：Anti-ANGPT4 抗体（1∶100）、Anti-β-actin 抗体（1∶5 000）。次日，将膜与羊抗兔二抗（1∶5 000）和山羊抗小鼠二抗（1∶5 000）在室温下孵育1 h。用增强化学发光（ECL）系统观察蛋白条带。重复3 次实验。使用ImageJ 软件分析蛋白的表达。

1.7 碱性磷酸酶（ALP）染色

成牙本质向分化诱导液培养hDPSCs 7 d 后，弃培养基，PBS 清洗3 次。室温下柠檬酸-丙酮-甲醛固定剂固定细胞40 s，去离子水清洗3 次，每孔加入300 μL ALP 染液。室温下避光孵育15 min，去离子水轻轻洗涤3 次。于倒置显微镜下观察。

1.8 茜素红S 染色

成牙本质向分化诱导液培养hDPSCs 14 d 后，弃培养基，PBS 清洗3 次。在室温下用70%冰乙醇在4 ℃条件下固定细胞1 h，去离子水清洗3 次，每孔加入300 μL 40 mM 茜素红S 染液。室温下置于摇床避光轻轻摇晃10 min，去离子水轻轻洗涤5 次。扫描后于倒置显微镜下观察。

1.9 统计学分析

计量资料以均数± 标准差表示。采用方差分析进行统计学分析，P＜0.05 为差异具有统计学意义，采用Excel 和Graphpad Prism（8.0.1）软件进行比较及作图分析。

2 结 果

2.1 人前磨牙中ANGPT4 的表达

人前磨牙HE 染色结果可见牙髓和牙本质结构。免疫荧光显示ANGPT4 在成牙本质细胞及下层多细胞区中高表达（图1）。

Figure 1 Results of HE and ANGPT4 immunofluorescence staining of human premolars图1 人前磨牙HE 和ANGPT4 免疫荧光染色结果

2.2 hDPSCs 的分离培养与鉴定

采用酶消组织块法分离培养hDPSCs，14 d 后观察到细胞集落，呈成纤维细胞样形态（图2a）。hDPSCs 传代后增殖迅速，呈旋涡状排列（图2b）。利用流式细胞术对hDPSCs 表面标记物进行分析，结果显示hDPSCs 表面标志物CD90（97.15%）和CD105（90.42%）阳性，而造血标志物CD34（0.08%）和CD45（0.01%）阴性（图2c-2f）。细胞多向分化能力检测发现，hDPSCs 经过成牙本质向诱导7 d后，ALP 染色呈阳性（图2g）；成牙本质向诱导14 d后，茜素红S 染色可见红色钙结节形成（图2h）；经过成脂向诱导30 d 后，油红O 染色可见红色脂滴形成（图2i）。以上结果证实分离得到的hDPSCs 高表达间充质干细胞表面标记物，低表达造血细胞表面标志物，并且具有多向分化潜能。

Figure 2 Isolation, cultivation and identification of hDPSCs图2 hDPSCs 的分离培养与鉴定

2.3 ANGPT4 在hDPSCs 成牙本质向分化过程中的表达

为明确ANGPT4 基因在hDPSCs 体外成牙本质向分化过程中的表达，将hDPSCs 在成牙本质向分化诱导培养基中培养0、1、5、7、11、14 d。提取总RNA 后，利用RT-qPCR 检测ANGPT4 和成牙本质细胞分化相关基因mRNA 水平的表达。在成牙本质向诱导后，与第0 天相比，ANGPT4 基因的表达量增加，在成牙本质向诱导的第5 天达到峰值（P＜0.001），第7 天时开始下降，但仍高于第0 天（P＜0.01），说明hDPSCs 成牙本质向分化过程中ANGPT4的表达上调。在hDPSCs分化过程中，RUNX2的mRNA水平在第5天达到峰值，第7 天维持较高水平，第11天开始下降，而DMP1和DSPP的mRNA水平在第5 天达到峰值，此后维持在较高水平（图3）。

Figure 3 Expression of ANGPT4 and odontoblast marker genes during odontogenic differentiation of hDPSCs图3 hDPSCs 成牙本质向诱导分化过程中ANGPT4 和成牙本质细胞标记基因的表达

2.4 在hDPSCs 中沉默ANGPT4 的表达

首先，为了明确转染条件，利用荧光标记（FAM）的siRNA（75 pmol/mL）进行转染，以加入相同体积的GP-transfect-Mate 转染试剂作为对照（Con），24 h 后荧光显微镜下可见转染组hDPSCs 几乎均呈绿色，而对照组未见绿色荧光，与对照组相比，转染组细胞生长状态未见异常（图4a），说明该转染条件可行，可用于后续实验。用相同的条件转染si-ANGPT4，以转染Scrambled siRNA（NC）为对照组。结果发现，与NC 组相比，si-ANGPT4 组ANGPT4 的mRNA 表达水平在24 h 开始显著下调（P＜0.01）（图4b）。同时，Western blot 结果显示，与NC 组 相 比，转 染96 h 后si-ANGPT4 组ANGPT4的蛋白表达水平也下调，且具有显著差异（P＜0.05）（图4c-4d）。这说明通过siRNA 沉默ANGPT4具有较高的沉默效率，可用于后续实验。

Figure 4 Silencing ANGPT4 expression in hDPSCs图4 hDPSCs 中沉默ANGPT4 的表达

2.5 沉默ANGPT4 降低了hDPSCs 成牙本质向分化的能力

为了探讨ANGPT4 在hDPSCs 成牙本质向分化过程中的作用，利用ALP 染色和茜素红S 染色分别检测成牙本质向诱导7 d 和14 d 的NC 组及si-ANGPT4 组hDPSCs 的ALP 活性和矿化结节形成（图5）。ALP 染色结果显示，与NC 组相比，si-ANGPT4 组ALP 染色强度和面积明显降低。茜素红S 染色结果显示，与NC 组相比，si-ANGPT4 组未见明显红染的矿化结节。这些结果表明，沉默ANGPT4 后hDPSCs 的成牙本质向分化能力受到抑制。

Figure 5 Silencing ANGPT4 inhibits the odontogenic differentiation of hDPSCs图5 沉默ANGPT4 抑制hDPSCs 成牙本质向分化

3 讨 论

牙髓是一种具有血管供应和神经支配的结缔组织，在各种刺激和创伤下具有一定的自我愈合的能力，这主要归因于其内部的牙髓干细胞在特定信号分子和生长因子的作用下可以分化为成牙本质细胞、形成修复性牙本质，以维持牙的正常生理功能［11］。然而，当牙髓受到强烈的刺激时，可能导致牙髓坏死，丧失再生潜力［12］。目前，研究多基于组织工程原理，利用细胞、支架和生物活性分子实现牙髓-牙本质再生［13］。其中，基于牙髓干细胞的组织工程已成为临床治疗中新的研究热点［14］。

hDPSCs 的成牙本质向分化是牙髓-牙本质再生中牙本质再生的关键。研究发现hDPSCs 来源的外泌体可显著促进hDPSCs成牙本质向分化［15］。MicroRNA和LncRNA 在调控hDPSCs 成牙本质向分化中发挥重要作用［16-17］。研究表明，机械加压通过丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路可以促进hDPSCs 的成牙本质向分化［18］。更重要的是，多种生长因子在调节hDPSCs 成牙本质向分化中起重要作用，如骨形态发生蛋白-2（bone morphogenetic protein-2，BMP2）、转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGFβ）、成纤维细胞生长因子-2（fibroblast growth factor-2，FGF2）、血小板衍生生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）和血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等均可调控hDPSCs的成牙本质向分化［19-20］。生长因子不仅能促进hDPSCs 的成牙本质向分化，并可在体内改善hDPSCs 介导的牙髓-牙本质复合体再生［21］。然而生长因子及其受体途径与hDPSCs 分化之间的信号网络尚未完全阐明。从应用治疗的角度来看，鉴定调节hDPSCs 成牙本质向分化的新分子对于组织工程治疗牙髓-牙本质再生是必要的。ANGPT4 是一种特定的生长因子，通过TIE2 途径产生稳定和成熟的血管系统。在本实验中，明确了ANGPT4 在人前磨牙中的成牙本质细胞中特异性表达，并且证实ANGPT4 是hDPSCs 成牙本质向分化所必需的，从而为生长因子调节成牙本质细胞分化提供了实验依据。

本实验对人前磨牙进行ANGPT4 免疫荧光染色，结果显示，ANGPT4 在人前磨牙成牙本质细胞及成牙本质细胞下层多细胞区中高表达。以往研究表明，牙髓祖细胞位于成牙本质细胞下层的多细胞区，当它们受到特定信号分子的刺激时，它们的DNA 没有任何复制，被认为参与了细胞分化过程，这些细胞可能来源于分化为成牙本质细胞之前正在分裂的前成牙本质细胞［22］。这提示ANGPT4可能在成牙本质细胞分化过程中发挥重要作用。这提示ANGPT4 可能在成牙本质细胞分化过程中发挥作用。此外，免疫荧光染色结果显示ANGPT4在小鼠下颌切牙和人前磨牙牙髓血管周围均有表达。由于牙髓血管生成和牙本质形成之间存在相互调控，并且本课题组前期的研究结果证实hDPSCs表达ANGPT4 的受体TIE2，因此，笔者推测血管内皮细胞产生的ANGPT4 可能参与牙发生早期血管周围hDPSCs 的分化。

hDPSCs 作为牙髓-牙本质再生组织工程重要的干细胞来源，是神经嵴来源的间充质干细胞，表达间充质干细胞表面标志物，并且具有类似于间充质干细胞的多向分化潜能［23］。为了证实从第三磨牙中分离出的细胞为hDPSCs，本实验对其表面标志物和分化潜能进行了验证。流式细胞术检测结果显示，hDPSCs 表达间充质干细胞标记物CD105 和CD90，而不表达造血干细胞标记物CD45和CD34。将hDPSCs 进行成牙和成脂向分化诱导，染色结果显示ALP 活性增高并且形成了矿化结节和脂滴，证明其具有多向分化潜能。以上结果证实了hDPSCs 的间充质干细胞的特性。

为了探究ANGPT4 在hDPSCs 成牙本质向分化过程中的表达，将hDPSCs 在体外进行成牙本质向诱导，选取不同时间点提取RNA，检测ANGPT4 及成牙本质细胞相关基因的表达。结果表明，ANGPT4 在hDPSCs 体外成牙本质向诱导过程中呈高表达，在第5 天时表达水平最高，随后呈下降趋势，与RUNX2 基因的表达模式相似。RUNX2 基因是成牙本质细胞分化的重要转录因子，在牙髓干细胞分化早期表达上调，并且可以调控DSPP 等矿化相关基因的表达，而在终末分化的成牙本质细胞中表达下调，有利于牙本质的形成［24-25］。这提示ANGPT4 可能促进了hDPSCs 的早期分化，并可能进一步调控分化晚期和矿化相关基因的表达。

为探究ANGPT4 在hDPSCs 成牙本质向分化中的作用，采用siRNA 基因沉默技术沉默hDPSCs 中ANGPT4 的表达。ALP 和茜素红S 染色结果显示，沉默ANGPT4 后抑制了hDPSCs 中ALP 的活性和矿化结节的形成。上述结果表明，ANGPT4 可能促进了hDPSCs 成牙本质向分化。

以往研究表明，ANGPT4 可通过TIE2/PI3K 途径促进静脉发育［26］，血管生成素家族成员ANGPT1可通过TIE2 介导的PI3K/AKT 信号通路促进MSCs的成软骨和成骨分化［27］。由于PI3K/AKT 信号通路 参 与hDPSCs 分 化［28］，因 此 推 测ANGPT4 促 进hDPSCs 分化可能与激活上述信号通路有关，但具体机制有待进一步探究。同时，本实验发现ANGPT4在牙髓血管内皮细胞中表达。由于ANGPT4 是一种分泌蛋白，前期研究表明hDPSCs 表达其受体TIE2，因此推测ANGPT4 可以通过旁分泌的方式作用于血管周hDPSCs，这一点将在接下来的研究中进行验证。综上，本实验发现了人牙中的成牙本质细胞及下层多细胞区表达ANGPT4，并且通过体外实验提示ANGPT4 可能促进hDPSCs 的成牙本质向分化，其具体分子机制以及潜在的临床应用有待进一步探究。

【Author contributions】Fan XY designed the study, performed the experiments and wrote the article.Liu CW, Zhou YJ, Ren FL, Shi C,Sun HC designed the study, performed the experiments and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as submitted.