仿生再矿化肽及衍生物提高牙本质粘接耐久性的研究进展
2023-08-03冯杉杉丁景瑜侯妍妍金毅夫
冯杉杉 陈 欢 丁景瑜 侯妍妍 金毅夫 朱 松
牙本质粘接依靠粘接剂渗透到脱矿的胶原纤维网状结构和牙本质小管内并原位聚合,形成混合层和树脂突获得主要粘接固位力[1]。牙本质因有机物含量高和粘接剂中聚合物降解等因素难以形成高质量的混合层[1~4]。粘接界面是牙本质粘接的薄弱环节,其混合层质量及抗老化性能是影响粘接耐久性的关键。
诱导牙本质粘接界面混合层裸露的胶原纤维再矿化,可恢复牙本质硬度和减少胶原纤维的收缩塌陷和水解,重建牙本质粘接剂渗透不良区域的结构与功能,增强其封闭性,提升牙本质-粘接界面的稳定性[5]。
一、牙本质再矿化的作用机制
牙本质的生物矿化包括分泌有机基质和晶体矿化,胶原纤维在矿化过程中充当生物矿化的支架和模板,在牙本质基质中富含酸性氨基酸结构域的非胶原蛋白(non-collagenous proteins,NCPs)可以螯合大量钙离子形成无定形磷酸钙(amorphous calcium phosphate,ACP),并诱导其进入胶原纤维孔区,调控羟基磷灰石(hydroxyapatite,HAp)晶体在胶原纤维内外有序沉积[6,7]。生物矿化过程主要利用残留在胶原基质中的HAp,钙磷离子在脱矿的牙本质中以此作为成核位点异相成核[8,9]、成长,但此方式形成的晶体多在胶原纤维间,取向混乱[9]。
酸蚀后牙本质有机基质中几乎无残留的矿物晶体和HAp 种晶,无法诱导HAp 异相成核。此时再矿化分子通过静电吸引或建立渗透压平衡使类液态性质的矿化前驱体-ACP 向胶原纤维内纳米间隙定向沉积[10,11],形成高度有序的有机基质-无机复合物结构,恢复其生物力学性能和机械性能。
二、仿生再矿化肽及衍生物在牙本质粘接中的应用
研究显示脱矿牙本质用再矿化剂预处理可以改善其润湿性和提升微拉伸粘接强度[12]。体外实验中,再矿化肽8DSS、酪蛋白磷酸肽等可在脱矿牙本质表面诱导HAp 有序沉积,封闭牙本质小管,有效降低牙本质的渗透性,但目前主要用于治疗牙本质过敏症。
由于天然的NCPs 来源有限,提取和纯化过程复杂,研究主要针对NCPs 的仿生功能类似物,Ma[13]和Xiang[14]等发现在体外研究中聚电解质能够稳定ACP 并诱导其在胶原纤维内有序沉积。目前,仿生再矿化肽及衍生物提升牙本质粘接界面粘接耐久性是研究热点。本文将对釉原蛋白衍生多肽、牙本质基质蛋白1 衍生肽、相邻含相反电荷残基的促矿化肽等的应用及研究进展进行介绍。
1.釉原蛋白衍生多肽P26
釉原蛋白衍生多肽P26,是富含天冬氨酸(Asp)和谷氨酸(Glu)酸性磷酸化多肽[15],包含磷灰石结合区和自组装区,能促进HAp 在脱矿牙本质表面定向沉积,与底层牙体组织结合,增强机械性能[16]。圆二色谱和透射电子显微镜观察发现,P26 将HAp 自组装呈球状,紧密排列在胶原纤维轴线上[16],P26 处理后,开放的牙本质小管被致密的羟基磷灰石堵塞封闭,管间牙本质基质中的胶原纤维沉积矿物晶体增多。在体外实验中P26 介导HAp 晶体在脱矿牙本质原位成核,有效地促进胶原纤维矿化,显著增强浅层牙本质的硬度和弹性模量,将其生物力学性质恢复到接近天然水平[16,17],这有助于缓解牙本质敏感,减少继发龋以及提高牙本质粘接耐久性。
2.牙本质基质蛋白1 衍生肽pA 和pB
NCPs 主要包括牙本质基质蛋白1(dentin matrix Protein 1,DMP 1)和牙本质涎磷蛋白(dentin sialophosphoprotein,DSPP)等[18],其中DMP 1 与牙本质的生物矿化关系最密切,它不仅对胶原具有高度亲和力能,提供矿物成核位点促进胶原纤维内矿化,还可稳定调控ACP 的尺寸[8,19]。George 等将Ⅰ型胶原亲和序列DSESSEEDR 分别与DMP-1 中HAp结合域序列ESQES 和QESQSEQDS 连接[20,21],合成DMP-1 衍生肽pA(DSESSEEDR-Ahx-ESQES)和pB(DSESSEEDR-Ahx-QESQSEQDS)[22]。体外实验结果显示pA 和pB 可成功结合到胶原蛋白的特定区域,多肽pB 的再矿化效果优于pA,扫描电子显微镜(scanning electron microscopy,SEM)观察发现,用1:4 的pA 和pB 处理20 分钟后,在牙本质基质中矿物晶体在胶原纤维内沿轴线生长,诱导纤维内部和纤维间再矿化[22]。
3.含相反电荷残基的促矿化肽MPP3
天然矿化多肽或NCPs 的结构中都含有大量酸性氨基酸,其聚阴离子特性可螯合大量钙离子,形成矿化前驱体最后完成胶原纤维内矿化。近期研究发现,在两个结构无序、长度相同、序列相似的肽段中,相邻的带相反电荷残基的肽段比只有酸性残基的肽段再矿化速度更快,结晶矿物更多[23]。
促矿化多肽MPP3(PGEKADRAEKADRA)由相反电荷的氨基酸对组成,能吸引纳米级成核前驱体ACP 产生局部过饱和点,促进成核[24,25]。尽管MPP1和MPP3 具有相似的物理化学性质,但带相反电荷残基对数较多的MPP3 更易形成针状晶体[24]。在牙本质粘接前,学者用促矿化肽MPP3 预先处理1 分钟,SEM 观察发现,10 分钟后脱矿胶原纤维周围有针状颗粒沉积,60 分钟后牙本质表面形成连续的矿物层,可完全覆盖并封闭牙本质小管[24,25]。在体外模型中,MPP3 的矿化效果优于氟化物,人工乳牙龋模型应用10%MPP3+5% NaF 的清漆后,再矿化效果显著优于商品化清漆Durashield 和Embrace[26]。此外,在粘接前用MPP3 预处理牙本质能提升酸蚀-冲洗和自酸蚀模式粘接剂的粘接性能,其中在酸蚀-冲洗模式下,预处理10 分钟效果尤为显著[27]。这表明MPP3 显著快速矿化动力学,可促进牙本质胶原纤维间快速部分再矿化,增加牙本质中脱矿胶原的硬度,减少胶原的崩塌和降解。
何[27]设计两种带正负电荷非胶原蛋白仿生肽,研究发现SR-14 和NS-7 均可诱导胶原纤维内矿化,这也表明酸性氨基酸SR-14 或碱性氨基酸NS-7 都可通过静电吸引与胶原纤维的带电孔区结合,其中由于NS-7 的序列中正电荷位点数多,结合能明显大于SR-14,胶原纤维内矿化速度和效果更高。
4.多巴衍生再矿化肽DOPA-Ahx-(Gly)3-(Glu)5
贻贝粘附蛋白具有独特的抗潮湿粘接性能,并且富含大量儿茶酚基团氨基酸,3,4 二羟基苯丙氨酸(3,4-dihydroxyphenylalanine,DOPA)[28]。受贻贝粘附蛋白启发,Zhou[29]等在脱矿的牙本质上应用聚多巴胺涂层,发现聚多巴胺能与胶原纤维结合,有效封闭牙本质小管。研究表明多巴的儿茶酚基团能通过化学键与胶原纤维作用[30],谷氨酸具有较强螯合钙离子的能力[31]。为提升谷氨酸与钙离子的亲和力,学者在谷氨酸中设计一段含甘氨酸的刚性间隔域,构造出多巴衍生再矿化肽DOPA-Ahx-(Gly)3-(Glu)5[32,33]。脱矿的牙本质标本分别用1 mg/ml 的DOPA-Ahx-(Gly)3-(Glu)5、聚多巴胺、聚多巴等处理后置于再矿化液中10 天,SEM 显示,聚多巴胺、聚多巴和DOPA-Ahx-(Gly)3-(Glu)5 等均能部分封闭牙本质小管,其中DOPA-Ahx-(Gly)3-(Glu)5还能诱导内壁部分矿化[33]。多巴衍生再矿化肽的体外矿化效果已得到验证,有望缓解牙本质敏感。此外DOPA-Ahx-(Gly)3-(Glu)5 在牙本质仿生矿化研究应寻找持续的钙磷供应途径,并进一步缩短矿化时间,提高牙本质矿化度和仿生度,为其在牙本质底涂剂和粘接剂中应用,提升牙本质粘接耐久性的奠定基础。
5.抗菌-再矿化双功能肽
牙本质粘接界面处的继发龋是修复失败的主要原因之一,在粘接界面应用抗菌-再矿化双功能肽,可抑制致龋菌的定植和代谢,并显著提高粘接界面封闭性和完整性,提高牙本质粘接体系粘接质量。抗菌肽GH12 可抑制变形链球菌生物膜的形成,降低生物膜的生物量和生物活性[34],Wang 等[35]利用GH12 优异的抗菌效果,将再矿化肽TD7 与GH12的N-端结合,合成双功能多肽TDH19、TNH19 和TVH19,其中TVH19 的最低抑菌浓度为64μM,体外抗菌和再矿化能力最优。
研究表明,多肽与聚合物之间的非特异作用会限制肽的生物活性[36],在多肽序列中设计间隔域,不仅保留肽的活性构象,还为甲基丙烯酸酯(methacrylic acid,MA)单体提供偶联位点,粘接剂中聚合物在固化后还可保持再矿化性质[37]。有研究将添加间隔域10%羟基磷灰石亲和肽MA-HABP(GSGGGCML PHHGAC)混入亲水性粘接剂,拉曼光谱显示MA-HABP 处理试件区域形成新矿物结晶度更高[38],显著提升粘接界面处封闭性和完整性[39]。Yuca 等[40]在羟基磷灰石亲和肽HABP 和抗菌肽AMPM7 上分别添加间隔域GSGGG 和GGG,形成K-GSGGG-HABP和AMPM7(KGGGKWKRWWWWR-NH2)后,与MA偶联,添加到粘接剂中构建双功能粘接体系。当AMPM7 与K-GSGGG-HABP 结合后,最小抑菌浓度为31.3 μg/mL,多肽的活性间隔域显示出显著抗菌性。此外,SEM 和能量色散X 射线光谱对再矿化物表征发现当K-GSGGGHABP:AMPM7 为3:7 时,样本表面有大量球状晶体沉积,Ca/P 比为1.49 与磷酸三钙最接近[40,41],矿化物的稳定性高,溶解度低。抗菌-再矿化双功能肽的应用颇有前景,但在未来的研究中还应注重缩短临床操作时间,延长抗菌肽在抗菌时效,提升再矿化的效率,在致龋菌定植前迅速实现部分矿化,增强界面的抗菌性。
三、总结与展望
近年在优化混合层质量提高牙本质界面粘接耐久性方面取得较好成果,仿生再矿化肽及衍生物能促进矿物离子在胶原纤维内外有序沉积,有效诱导纤维间和纤维内胶原矿化,但胶原纤维内外再矿化对粘接界面处粘接强度和机械性能影响较大。根据“分子尺寸排斥理论”相对分子量小于6 kDa 的分子易扩散进入胶原原纤维内,相对分子量大于40 kDa的分子则无法进入[42],故再矿化肽及衍生物的形态和尺寸,以及在脱矿胶原基质中磷灰石沉积物的尺寸和结构层次都是需要特别关注的。
此外,聚合物诱导的液相前驱体(polymer induced liquid precursor,PILP)理论[43]认为聚阴离子化合物可使矿物离子形成稳定的、具有液态性质的ACP 液相前驱体,通过毛细作用ACP 渗入胶原纤维孔区,在特定位置成核,转化为HAp[44]。尽管仿生再矿化肽具有一定的聚电解质的特性,但相较于高度负电性的成核抑制剂有些再矿化肽在胶原表面诱导形成ACP 极不稳定,可能再矿化早期转化成HAp 而无法进入胶原纤维内部,所以对于成核抑制剂是否需要添加,种类选择和添加比例也是要探索的。
无论是在体内还是体外研究,再矿化肽都在水溶液中应用[45,46],未来还可以尝试将再矿化肽与较温和的酸蚀剂配合使用,并结合体内外实验指导修饰仿生再矿化多肽的序列,探索其在不同溶剂、不同的牙本质粘接系统中应用,确定最佳的应用形式,最适浓度以及处理时间,快速高效实现粘接界面处再矿化提高牙本质粘接的稳定性和耐久性,简化操作程序,提高临床应用的可行性。