miR-30a靶向ATG5轴调控自噬信号在支气管哮喘中的作用

佘巍巍 孙天寿 龙成凤 陈美宇 陈旭 廖覃雪 王明东

哮喘是一种高发的慢性肺部炎症性疾病,发病率和死亡率逐年上升[1]。支气管哮喘的病理特征为慢性炎症,支气管高反应性和气道重塑[2]。支气管慢性炎症随之而来的大量促炎细胞,致使支气管痉挛收缩、粘膜水肿和粘液分泌,并最终驱动支气管气道重塑[3]。据报道,自噬基因ATG5的遗传变异与促进气道重塑和儿童哮喘中肺功能的降低密切相关[4]。自噬在气道重塑中发挥重要作用,适当的自噬有助于逆转纤维化进程,缓解支气管哮喘气道重塑[5]。miR-30a是编码小RNA(miRNA)-30家族的一个成员。miR-30a参与不同细胞中Beclin 1介导的自噬过程的调节[6]。我们发现自噬相关蛋白ATG5与miR-30a存在潜在的结合关系。因此,本研究旨在探究miR-30a靶向ATG5轴调控自噬信号,参与哮喘中气道重塑的发病机制。

资料与方法

一、动物、材料与试剂

使用6～8周龄SD雄性大鼠共24只,重量约(200±20)g(采购于成都达硕实验动物公司),其生产许可证号为:SCXK (川) 2020-030。TGF-β1 ELISA试剂盒(货号:ZC-39043, 茁彩)、VEGF ELISA试剂盒(货号:ZC-38845,茁彩)、PDGF ELISA试剂盒(货号:ZC-38897, 茁彩)、IL-4 ELISA试剂盒(货号:ZC-37986,茁彩)、IL-13 ELISA试剂盒(货号:ZC-37967, 茁彩)、Masson三色特染试剂盒(G1340-7×50mL, 索莱宝)、重组抗体LC3B(货号:ab192890, abcam)、Beclin1(货号:ab207612, abcam)、ATG5(货号:ab108327, abcam)与β-actin(货号:ab8226, abcam)均购于abcam公司。

二、主要仪器

电泳仪、超薄切片机、实时荧光定量(qRT-PCR)仪(北京君意东方电泳设备有限公司)、玻璃制刀机、徕卡组织处理机、透射电子显微镜(日本电子JEOL)、倒置生物显微镜(上海徕卡显微系统贸易有限公司)。

三、研究方法

1 试验分组及大鼠支气管哮喘模型构建 随机将SD大鼠分为4组,对照组(n=6),模型组(n=6),模型+NC agomir组(n=6),以及模型+miR-30a agomir组(n=6)。适应性饲养1周后进行支气管哮喘模型构建,方法如下:大鼠第 1、8、15天分别腹腔内注射10 %卵清蛋白(OVA)和10 %氢氧化铝的混合液1.0 mL进行致敏[5]。于OVA致敏后第21 天开始雾化激发,将大鼠置于一密闭玻璃容器中,给予4% OVA雾化吸入(雾粒直径 3～5 μm),30 min/次,连续1周,以大鼠出现呼吸加快、口唇发绀、站立不稳等表现为模型构建成功。研究内容及方案符合实验动物伦理原则,经桂林医学院实验动物伦理委员会审查并批准(GLMC202203253)。

2 miR-30a agomir给药治疗 于支气管哮喘模型构建雾化激发起,模型+miR-30a agomir组大鼠与模型+NC agomir组分别在雾化前 1 h经气管注射 20 μg miR-30a模拟物(miR-30a agomir)与 miRNA模拟物(NC agomir)。模型组和对照组给予相同剂量的0.9%氯化钠液进行给药。1 次/天,连续1周,在最后一次雾化后 24 h 内断颈处死。

3 肺泡灌洗液采集及ELISA检测 于最后一次雾化结束后处死大鼠,双侧肺脏PBS灌洗量为1.2 mL, 反复灌洗3～5次并收集灌洗液。肺泡灌洗液1500 rpm,4℃离心10 min,取上清。其肺泡灌洗液中TGF-β1、VEGF、PDGF、IL-4与IL-13的含量采用ELISA试剂盒来进行检测定量。依据试剂盒生产厂家标准操作流程进行操作,于450 nm处测量各样本吸光光度值。

4 HE染色观测肺脏损伤情况 大鼠处死后,分别采集大鼠中段左肺,以10%的中性甲醛溶液固定。分级脱水后以石蜡包埋,常规切片为5 μm的薄片。烘干后,常规苏木精-伊红染色分析,以中性树脂封固进行观察。光学显微镜下以100倍,400倍观察肺脏损伤。

5 肺脏胶原沉积观察 采用Masson染色法进行染色,观察肺脏胶原沉积。肺组织常规切片,脱蜡至水后按照生产厂商指示进行染色,最后以中性树脂封固进行观察。经过染色操作后,肌纤维及细胞质呈现为红色,但是细胞核呈深蓝色,胶原纤维呈现蓝色。扫描蓝色的胶原纤维所占面积,并统计胶原沉积所占百分比。选择完整气道,分别测量支气管平滑肌层厚度(Md)、支气管基底膜周径(Pbm)、支气管管壁厚度(Wd)和平滑肌层面积(WAm)以及管壁总面积(WAt)。其结果将各标本组织基底膜周径(Pbm)进行统一标准化(即分别使用Md/Pbm、WAm/Pbm、WAt/Pbm、Wd/Pbm指标来评估气道重塑程度)[7]。

6 RT-PCR 法检测miR-30a与ATG5表达 大鼠肺组织样本分别以Trizol法提取总RNA,将总RNA逆转录为cDNA后实时荧光定量检测各组miR-30a与ATG5的表达。引物序列如下所列:miR-30a引物,上游:5′-GATCTCGAGCTCAAGTAGGGGCATATCTGAACGAGGCT-3′,下游:5′-GATTATCGATAAGCTTCAATGCTATAACACATTTCTTTGC-3′[8]; ATG5引物,上游:5′-GCACCTCGGGTCCGAGGT-3′,下游:5′-GGCTCTGCTTCTCGTTCAGTTATC-3′;内参引物U6,上游:5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′,下游:5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′[9]。反应条件为:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性10 s,58 ℃退火10 s,72 ℃延伸15 s,共35 个循环。2-△△Ct法计算每组miR-30a与ATG5基因的相对表达。

7 miR-30a agomir对肺泡自噬的影响 采用透射电镜观察肺泡上皮细胞自噬体的形成。送检肺组织以3%戊二醛进行固定,采用透射电镜观察肺泡上皮细胞自噬体的形成。送检肺组织以3%戊二醛进行固定。采用1%四氧化锇进行再次固定,使用丙酮进行逐级的脱水,再用Ep812进行包埋,其半薄切片再用甲苯胺蓝染色进行光学定位,然后采用钻石刀做出超薄的病理切片,联合枸橼酸铅和醋酸铀进行染色,采用透射电镜(型号JEM-1400FLASH)进行切片的观察。

8 Western Blot 检测各组大鼠肺组织中自噬蛋白 各组大鼠取左肺中段组织100 mg,匀浆后提取总蛋白,以BCA试剂盒测定蛋白浓度。取50 μg 蛋白质用于SDS凝胶电泳,电转至PVDF膜封闭,一抗:LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、Beclin1、ATG5孵育过夜后洗涤,二抗:孵育30 min,再次洗涤,ECL显色。以β-actin为内参,定量LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值、Beclin1、ATG5表达情况。

四、统计学方法

结 果

一、哮喘大鼠肺组织中miR-30a与ATG5的表达水平

qRT-PCR分析结果显示,与对照组相比,模型组大鼠肺组织中miR-30a表达下调,ATG5表达上调。与模型+NC agomir组相比,miR-30a agomir治疗后,miR-30a表达上调,ATG5表达下调(见表1)。

表1 荧光定量PCR分析各组大鼠肺组织中miR-30a与ATG5的表达水平

二、各组大鼠肺组织病理损伤HE染色结果

对照组小鼠的切片HE染色结果为支气管和肺泡的相应结构基本正常,无水肿和增生现象。和对照组小鼠的切片相比较,模型组小鼠的切片HE染色后肺泡间隔有较大的增宽,表现为肺泡上皮细胞和成纤维细胞增生,间质内有以中性粒细胞为主的炎性细胞浸润。模型+NC agomir组气管上皮细胞形态正常,有少量支气管上皮细胞脱落,间质内有与模型组类似的炎性细胞浸润。与模型组及模型+NC agomir组相比,模型+miR-30a agomir组无肺泡间隔增厚现象,无明显支气管上皮细胞脱落,间质内炎性细胞浸润减少(见图1)。

图1 各组大鼠肺组织HE染色(×400)A: 对照组;B:模型组;C:模型+NC agomir组;D:模型+miR-30a agomir组

三、miR-30a agomir治疗对哮喘大鼠肺组织气道重构与胶原沉积的影响

光镜下Masson染色及统计结果可见,相较于对照组,支气管哮喘模型组肺组织胶原纤维沉积显著增多,而相较于模型+NC agomir组,miR-30a agomir治疗明显降低了胶原纤维在支气管壁与肺泡壁的沉积。与Masson染色相吻合的是Wd、Md、WAt与WAm均显示与胶原纤维沉积率相同的趋势(见图2,3及表2)。表明miR-30a agomir治疗对支气管哮喘导致的气道重塑有明显的减轻作用。

图2 Masson染色观察各组大鼠肺组织胶原沉积(×400)A:对照组; B:模型组; C:模型+NC agomir组; D:模型+miR-30a agomir组

图3 胶原纤维沉积率统计结果注:与对照组相比,***P<0.001;与模型+NC agomir相比,###P<0.001

表2 miR-30a agomir治疗对哮喘大鼠气道重塑的影响

四、各组大鼠肺泡灌洗液中TGF-β1、VEGF、PDGF、IL-4及IL-13的含量变化

ELISA检测TGF-β1、VEGF、PDGF、IL-4及IL-13的含量变化。在对照组大鼠血清中,TGF-β1、VEGF、PDGF、IL-4及IL-13均呈低表达,而在支气管哮喘造模后,其表达均显著上调。与模型+NC agomir组相比,miR-30a agomir治疗显著降低了TGF-β1、VEGF、PDGF、IL-4及IL-13的表达。揭示了miR-30a agomir对纤维化与炎症的抑制作用(见表3)。

表3 ELISA检测TGF-β1、VEGF、PDGF、IL-4及IL-13的含量变化

五、miR-30a agomir治疗对哮喘大鼠肺组织自噬的影响

为观察miR-30a agomir治疗对大鼠肺组织自噬的影响,透射电镜用于观察肺组织中肺泡上皮细胞自噬小体,WB用于检测LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、ATG5和Beclin1的表达。(如图4)所示,对照组大鼠肺泡上皮细胞自噬小体数量较模型组少,而相对于模型+NC agomir组,miR-30a agomir治疗明显减少了自噬小体的数量。与之吻合的是,LC3-Ⅱ/ LC3-Ⅰ比例、ATG5 和Beclin1均在哮喘造模后表达上调,而在miR-30a agomir治疗后表达下调(见图5,表4)。结果证明miR-30a agomir治疗有助于靶向抑制ATG5表达并抑制肺组织过度自噬。

图4 透射电镜观察肺泡上皮细胞自噬小体(×8000)A:对照组; B:模型组; C:模型+NC agomir组; D:模型+miR-30a agomir组

图5 WB检测各组大鼠肺组织LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、ATG5、Beclin1蛋白表达

表4 WB检测各组大鼠肺组织LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、ATG5、Beclin1蛋白表达

讨 论

微小核糖核酸(miRNA)是小于22个核苷酸和高度保守的调节性非编码RNA[10]。以往的研究表明,miRNAs调节哮喘发生,并且是治疗该病的潜在目标。Malmhäll等人的研究表明,miR-155敲除后导致嗜酸性粒细胞炎症和粘液分泌减少[11]。Collison等人证明,miR-145下调抑制了嗜酸性粒细胞炎症、粘液过度分泌以及2型(Th2)细胞因子的产生[12]。在目前的研究中,miR-30a在哮喘大鼠肺组织中表达下调,ATG5在哮喘大鼠肺组织中表达上调,而miR-30a agomir的治疗逆转了哮喘导致的ATG5上调,表明miR-30a与ATG5存在靶向调控关系。

由于支气管哮喘是一种长期的慢性炎症,长期的慢性炎症导致支气管纤维化最终造成气道狭窄,即气道重塑[13]。支气管气道重塑的主要特征是气道壁增厚、上皮下纤维化、平滑肌质量增加、支气管粘液腺和毛细血管网生成增多[14]。降低炎症,减少纤维化是治疗支气管哮喘、逆转气道重塑的指导方针。从病理结果与气道重构评分结果来看,miR-30a高表达对改善哮喘大鼠的病情很有帮助,不仅降低肺泡上皮细胞和成纤维细胞增生,还减少了炎性细胞的浸润,同时降低了胶原纤维在气道的沉积,以及支气管的厚度。与之吻合的是,ELISA的结果证实,miR-30a agomir治疗降低了炎症细胞因子IL-4及IL-13的表达。据报道,在哮喘模型中,过敏性气道炎症产生IgE,而IgE刺激肥大细胞以及嗜酸性粒细胞进一步分泌相应的细胞因子,包括IL-4、IL-5和IL-13[15]。此外,miR-30a agomir治疗降低了TGF-β1、VEGF与PDGF的表达。据报道,TGF-β1、VEGF与PDGF三者均可由肥大细胞所表达[16]。其中,TGF-β1是一种促纤维化细胞因子[17];VEGF是血管生成的主要诱导因子,刺激滋养细胞增殖[18];PDGF作为免疫调节因子能促进成纤维细胞增殖[19]。三者均被认为在慢性哮喘中发挥重要作用,其降低提示miR-30a可抑制气道纤维化,miR-30a可能成为支气管哮喘潜在治疗药物。

在前期研究中,我们证实了miR-30a 有降低过敏性气道炎症与抑制气道重构的作用,但其具体分子机制还未被证实。由于miR-30a agomir治疗导致了气道纤维化的抑制与自噬相关蛋白ATG5的下调。因此我们推测miR-30a对气道重构的抑制作用与自噬有关。以前的研究资料表明,抑制ATG5介导的自噬可调节内质网应激和CD4+T淋巴细胞分化,进而逐步减小支气管哮喘的气道重塑以及气道慢性炎症[20]。而我们的研究发现miR-30a agomir治疗抑制了肺组织的自噬,主要表现为自噬小体数量减少与蛋白ATG5、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ和beclin-1的下调。因此我们可以得出结论,miR-30a可能通过靶向抑制ATG5表达而减轻气道自噬水平,从而减轻气道炎症,抑制气道纤维化,达到抑制气道重构的效果。本研究将对miR-30a治疗支气管哮喘的进一步研究奠定基础。