老年男性沃辛瘤Th淋巴细胞亚群及细胞因子检测的实验研究*

王凤凤，李传真

沃辛瘤肿瘤上皮为假复层结构的嗜酸性上皮细胞，肿瘤间质为淋巴样组织，其内常见淋巴滤泡形成，这与淋巴结相类似。从胚胎发育学来说，沃辛瘤是由于腮腺导管上皮细胞迷走于腮腺内的淋巴结发生瘤变而成[1]，沃辛瘤淋巴间质来源于胚胎时期的淋巴组织。本文主要对沃辛瘤淋巴间质中Th 淋巴细胞亚群及细胞因子分布特点研究。

1 材料与方法

本实验研究方案遵循赫尔基宣言的伦理原则，获得海南医学院第二附属医院伦理委员会的审批（编号：LW2018076）。收集2018 年8 月至2020 年8 月于海南医学院第二附属医院就诊的32 例腮腺沃辛瘤男性患者，中位年龄61 岁，均在我科行手术切除，且病理诊断为沃辛瘤。

1.1 实验方法

1.1.1 Th 淋巴细胞亚群鉴定 随机选取收集的腮腺沃辛瘤标本中24 例，应用免疫组化检测T-bet(Th1)、Gata3(Th2)、RORγt(Th17)、Foxp3(Treg) 表 达 情况。以上抗体均购自Abcam 公司，免疫组化试剂盒(二抗）购自博士德生工生物有限公司。10%的福尔马林固定液固定，制作石蜡切片（4um），每一例标本制作4 张切片，常规脱蜡、梯度酒精脱水，阳性对照组分别为抗T-bet、Gata3、RORγt 及Foxp3+Treg 抗体，抗体滴度均为1：100，PBS 替代一抗加入切片Foxp3+Treg 抗体，作为阴性对照组，DAB 显色，苏木素复染。细胞核棕褐色着色为阳性表达，正置显微镜下观察、计数。

1.1.2 应用GSH-INF-3-1 抗体芯片技术检测8 例沃辛瘤标本相关细胞因子（由上海华盈生物公司完成），将各细胞因子表达量进行Zscores 转换，采用R3.6.0 语言进行非聚类分析形成热图。

1.2 统计学方法

1.2.1 Th1、Th2、Th17、Treg 淋巴细胞亚群阳性细胞占比 将24 例标本中Th1、Th2、Th17 及Foxp3+Treg 阳性表达使用病理图像采集和分析系统（OLYMPUS cellSens Dimension）进行检测：高倍镜下随机选取5 个视野，使用软件的“染色功能”，标记选中视野中所有阳性细胞。利用软件中“擦除功能”，人工核对原图片，排除“假阳性”的标记区域，对阳性细胞进行计算，得出结果，取5 个视野平均值，此基础上再取24 例标本的±s(%)，得到实验数据。然后用origin 软件形成散点间距图。

1.2.2 热图使用方法 将各因子表达量进行Zscores转换，R 热图包（heatmap，ggplot2）选择非聚类的方法进行展示。

1.2.3 R 语言分析细胞因子表达相关性 采用R 语言分析细胞因子之间表达相关性，分析结果以红色表示正相关，蓝色表示负相关，颜色强度越高表示相关性越强，并且以白色星号（*）表示显著性，其中*表示显著相关（P ＜0.05），**表示非常显著相关（P＜0.01），***表示极显著相关（P＜0.001）。

2 结 果

2.1 Th 淋巴细胞亚群分布情况 T-bet、Gata3、RORγt 阳性细胞分布于GC 外周，大部分Foxp3+Treg 阳性细胞分布在GC 外周，同时在GC内部成零星分布，如图1 所示。Th1、Th2、Th17及Foxp3+Treg 阳性细胞占比（±s，%）为2.48±2.129、0.70±1.101、0.97±1.002 及6.26±3.567，Th1/Th2、Th17/Foxp3+Treg 阳性细胞占比之间比值分别为3.5/1、1/6.5。散点间距图，如图2 所示。

图1 Th 淋巴亚群细胞免疫组化阳性表达（箭头所示），图片倍数为：×20

图2 Th1、Th2、Th17 及Foxp3+Treg 阳性细胞占比散点间距图

2.2 沃辛瘤细胞因子抗体芯片检测结果

2.2.1 沃辛瘤细胞因子表达情况热图分析 用GSH-INF-3-1 抗体芯片技术检测的40 个细胞因子（IL-1α、IL-1ra、IL-4、IL-17、MCSF、MIP-1a、BCL、Eotaxin、Eotaxin-2、G-CSF、GM-CSF、I-309、ICAM-1、IFNγ、IL-1β、IL-2、IL-5、IL-6、IL-6sR、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12p40、IL-12p70、IL-13、IL-15、IL-16、MCP-1、MIG、MIP-1b、MIP-1d、PDGF-BB、RANTES、TIMP-1、TIMP-2、TNFa、TNFb、TNF-R Ⅰ、TNF-R Ⅱ），对检测结果进行热图分析，结果表明沃辛瘤中ICAM-1、IL-8、IL-16、MIP-1b、PDGFBB、RANTES 及TIMP-2 表达程度相对较高（图3）。

图3 细胞因子表达量热图分析

2.2.2 应用R 语言分析沃辛瘤各细胞因子之间表达相关性 衰老相关分泌表型重要因子IL-1β、IL-6 及TNF 与多种炎性因子表达呈显著正相关。IL-10、GM-CSF、IL-11、IL-7、IL-13、IL-12p70及IL-2 与TNF 表达密切相关，IL-6sR 与TNF-R

3 讨 论

丰富的淋巴间质是沃辛瘤病理特征之一，Th1、Th2、Th17 淋巴细胞亚群主要分布在非淋巴滤泡的淋巴间质区域，Foxp3+Treg 分布于淋巴滤泡外周、淋巴滤泡边缘及淋巴滤泡内，这与文献报告结果相一致[2]，Foxp3+Treg 数量明显高于Th1、Th2 及Th17。从胚胎发育学上来说，沃辛瘤淋巴间质来源于胚胎时期的淋巴组织，文献资料显示正常淋巴组织中Th1／Th2 比值为1/1，而Th17/Treg 比值为1/5[3]，而沃辛瘤中Th1 ／Th2 比值为3.5/1，Th17/Foxp3+Treg 比值为1/6.5。沃辛瘤Foxp3+Treg 数量相对增多可能与淋巴间质增龄性变化有关。研究表明，外周血及淋巴组织Fopx3+Treg 细胞在不同年龄段的人群及小鼠含量有一定差异，Foxp3+Treg 随年龄增大而增加[4-7]。小鼠也存在Foxp3+Treg 增龄性变化，月龄大于20周的Balb/c 小鼠无论是外周血还是脾、淋巴结，CD4+CD25+Treg 比例明显增加[8]。Foxp3+Treg 的主要功能之一是抑制炎症反应，其数量增多可能与沃辛瘤炎症反应程度较强烈有关。

TNF-α，IL-1β，IL-6是非常重要的促炎因子[9-11]，它们在沃辛瘤中均有表达，并且这些因子与许多炎表达密切相关；IL-8、TIMP-2 分布与IL-1β 表达相关；与IL-6 表达相关的主要包括PDGF-BB、IL-15、IL-1α、IL-5、IL-11、IL-7、TNF-β、IL-12p70 及IL-2（图4）。CXCL13 及ICAM-1 为淋巴滤泡形成重要因子，与CXCL13 表达相关的主要包括TNF-R Ⅰ、TIMP-1、G-CSF、IL-16、MIP-1d、MIG 及I-309,与ICAM-1 表达相关主要有TNF-R Ⅱ及IL-6sR。性因子的表达呈密切相关，如IL-10、GM-CSF、IL-11、IL-7、IL-13、IL-12p70，形成复杂的细胞因子网络。沃辛瘤淋巴间质呈典型慢性淋巴结表现，这些炎性因子组成有利于慢性炎症发展的细胞因子网络，这可能在维持沃辛瘤慢性炎症表现中起重要作用。同时，TNF-α，IL-1β，IL-6也是衰老相关分泌表型（senescence-associated secretory phenotype ,SASP）的重要细胞因子[12]。沃辛瘤好发于老年患者，其淋巴间质增龄性变化可能促进TNF-α，IL-1β，IL-6 等促炎因子广泛表达，这些促炎因子促进淋巴间质发展及淋巴滤泡增生，这可能是沃辛瘤好发于老年吸烟患者的原因之一。

图4 细胞因子之间相关性R 语言分析

CXCL13 及ICAM-1 是生发中心形成过程中起重要作用的细胞因子[13-14]。本研究中，沃辛瘤TNF 与CXCL13、ICAM-1 表达呈正相关，而研究表明TNF-α 可以促进血管内皮表达ICAM-1及巨噬细胞分泌CXCL13,TNF-β(lymphotoxin-β)可诱导成纤维网状细胞分泌CXCL13[15-17],因此TNF-α-TNF-β 可能参与沃辛瘤淋巴滤泡形成。此外，IL-12p40 与CXCL13 表达密切相关，IL-12p40 可以单体形式存在，或者分别与p35、p19 亚基结合，形成有活性的IL-12（IL-12p70）及IL-23。本研究表明，IL-12p70 与CXCL13 表达无相关，提示IL-12p40 可能通过IL-23 促进沃辛瘤CXCL13 表达，但仍需进一步实验证实。沃辛瘤淋巴间质增龄性变化有促于淋巴间质的发生发展，这可能是沃辛瘤好发于老年患者的病理生理基础。