高分辨率熔解曲线检测背景下结核分枝杆菌链霉素和乙胺丁醇耐药模式分析

郭腾飞,王珍珍,,侯 义,赵战勤,祖向阳,江 涛,薛 云

结核分枝杆菌感染是世界常见的单病种死亡病因之一[1]。中国是结核病高负担国家[2]。结核的传播及耐药模式具有地域差异,而监测数据的不完全性,阻碍了结核的及时诊断及耐药的风险评估。近年来分子检测技术广泛地应用于临床,使耐药结核(drug-resistant tuberculosis,DR-TB)患者的精准防控成为可能。其中HRM技术能同时分析多种抗结核药物的分子易感性,用于补充结核感染和分子耐药的流行病学资料。乙胺丁醇(ethambutol,EMB)和链霉素(streptomycin,SM)是治疗 DR-TB 的第一组药物,但其耐药模式在该地区却是空白。引起结核乙胺丁醇耐药(ethambutol resistance,EMB-R)的分子机制主要是基因EmbB和EmbC突变;链霉素耐药(streptomycin resistance,SM-R)主要是由基因rrs和Rpsl 43及88位密码子的突变引起[3-4],不同国家和地区的结核耐药突变位点也有所不同。该研究旨在结核感染群体特征的宏观现象上,分析EMB及SM的耐药特征及耐药在碱基水平的微观表现,这将有助于改进现有的快速耐药检测技术,探索药物活性的新靶点。

1 材料与方法

1.1 病例资料该研究对洛阳市和县区(偃师县、栾川县、嵩县县、汝阳县、洛宁县、孟津县、新安县、宜阳县、伊川县)2019年1月—2021年 12月期间所有的临床确诊及疑似病例的痰液、胸水或肺泡灌洗液行HRM扩增后将阳性结果纳入分析。分析前按照姓名、性别、年龄、地区等因素排除重复检测者,将年龄<15岁和年龄>86岁的个体汇总为单一年龄类别,其他均按5年为一个单位。变量包括检测日期、HRM阳性结果(乙胺丁醇和链霉素耐药结果)、性别、年龄、地区(县区统一归为乡镇区域)、痰涂结果和系统记录或自我报告的治疗史。

疑似和确诊病例:经临床诊断已明确有结核分枝杆菌感染或过往感染的群体;抗结核治疗失败,有结核治疗史或既往结核感染未彻底治愈;有临床症状或潜伏感染者;免疫病理有结核分枝杆菌感染特征者;影像学有感染提示者;排菌患者密切接触者;结核菌素试验强阳反应。

1.2 病例诊断标准根据中华人民共和国卫生行业标准(WS196-2017)[5],根据治疗史对患者进行分类,初治结核病。初治患者指符合下列情况之一:① 从未因结核病应用过抗结核药物治疗的患者;② 正进行标准化疗方案规则用药而未满疗程的患者;③ 不规则化疗未满1个月的患者。复治患者指符合下列情况之一:① 因结核病不合理或不规则用抗结核药物治疗≥1个月的患者;② 初治失败和复发患者。

1.3 基因突变位点检测该研究采用HRM针对EMB耐药高突变的embB基因(embB 306、embB 406、embB 497、embB 368/378/380)进行检测,SM检测主要是rpsL基因43、88位密码子和rrs基因的513～517位点及905～908位点。

1.4 统计学处理使用STATA/SE 15.1软件对所有可能与EMB-R和SM-R发生有关的变量纳入多变量Logistic回归分析,同时对不同治疗史、区域分布、痰涂结果背景下的性别及耐药情况行Pearson卡方检验。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 按性别分层的链霉素和乙胺丁醇耐药结果2019—2021年,该地区共有2 941例非重复HRM阳性病例中SM、EMB耐药率初诊患者分别为17.3%和7.4%,复治患者分别为25.8%和12.1%,城市患者分别为21.3%和9.8%,农村患者分别为16.6%和6.9%,痰涂阳性人群分别为17.8%和6.9%,痰涂阴性分别为19.2%和9.0%。SM-R和EMB-R按性别分层检出性差异见表1。

表1 HRM阳性人群特征及在不同因素下SM-R和EMB-R情况[n(%)]

2.2 不同变量下的链霉素和乙胺丁醇耐药结果SM-R和EMB-R因性别、年龄、结核治疗史及地区分布有关。总体而言,在结核分枝杆菌感染患者中,SM耐药率男性为19.0%,女性为16.5% (χ2=2.309,P=0.129),EMB耐药率男性为8.0%,女性为7.9%(χ2=0,P=0.987)。初诊和复诊群体中SM耐药率分别为17.3%和25.8% (χ2=15.192,P<0.001),而EMB耐药率则为7.4%和12.1%(χ2=9.557,P=0.002)。该研究对初复诊群体不同性别的EMB-R和SM-R检出率行χ2检验分析显示,EMB-R差异存在于初诊男性及复诊男性之间(χ2=6.340,P=0.012)及初诊女性与复诊男性之间(χ2=5.786,P=0.016);SM在复诊男女之间耐药率差异无统计学意义(χ2=0.690,P=0.406)。在城市和乡村患者中SM的耐药率分别为21.3%和16.6%(χ2=9.927,P=0.002),EMB的耐药率分别为9.8%和6.9%(χ2=8.115,P=0.004)。SM-R的检出无论是乡村男女,还是城市与乡村的男女之间均有差异,但在城市男女之间差异无统计学意义(χ2=0.850,P=0.356);而EMB-R在城市与乡村不同性别之间耐药性差异更不明显。痰涂阳性群体对SM和EMB耐药率分别为17.8%、6.9%,而痰涂阴性为19.2%、9.0%。EMB-R在痰涂阳性和痰涂阴性群体之间的差异有统计学意义(χ2=3.979,P=0.028),SM-R在痰涂阳性群体男女之间的差异有统计学意义(χ2=5.974,P=0.015)。对不同年龄范围群体的耐药率分析可知,年龄<51岁群体对SM耐药率高于年龄>50岁群体(χ2=12.572,P<0.001)。

2.3 按年龄分层的耐药结果SM耐药率最高的年龄范围是31～35岁(32.2%),与其他所有年龄类别相比,31～35岁的男性(38.9%)及56～60岁女性(26.7%)对SM耐药率最高。EMB耐药率高峰出现在21～25岁(12.7%)的年龄范围,男性对EMB耐药率峰值(15.8%)与总体EMB耐药率一致,均是21～25岁,女性对EMB耐药率峰值的年龄范围依旧是56～60岁,耐药率为12.8%。按年龄类别分类的HRM阳性结果总数以条形图表示,SM和EMB耐药率以折线表示(第二y轴)。见图1。

图1 按年龄和性别分类的HRM阳性结果及SM-R和EMB-R的比例A:按年龄和性别分类的HRM阳性结果例数及SM耐药率;B:按年龄和性别分类的HRM阳性结果例数及EMB耐药率

2.4 多因素Logisitic回归分析结果采用多因素Logisitic回归分析来确定性别、年龄、治疗史、地区、痰涂、年份是否与SM-R及EMB-R的检出相关。结果显示,男性、年龄<51岁、城市和结核治疗史均与SM-R和EMB-R风险增加呈正相关(表2)。在调整了痰涂结果和检测年份的影响后,男性被诊断为SM-R的可能性高于女性;51岁及以下被诊断为SM-R的可能性高于50岁以上个体;与无治疗史个体相比,有结核治疗史被诊断为SM-R及EMB-R的可能性更高;城市群体被诊断为SM-R和EMB-R的可能性高于乡村。

表2 链霉素耐药和乙胺丁醇耐药的多项式Logistic回归分析[n(%)]

2.5 引起链霉素和乙胺丁醇耐药基因位点引起SM-R的基因突变中,单位点突变率为91.8%,其次是双位点8.2%。在单位点突变中,rpsL 43位密码子突变率最高,为59.0%,其次是rpsL 88和 rrs 905～908位点,在全部突变模式中分别占16.4%和13.1%,另外有rrs 513～517单位点突变率为3.3%;另外该研究表明rpsL 43联合 rrs 905～908及rpsL 88联合 rrs 905～908位点的双位点突变率分别为4.9%、3.3%。而EMB-R的分子突变位点中,只发现了单位点突变,其中embB 306、embB 406、embB 497和embB 368/378/380的突变率分别为66.7%、18.4%、10.7%和4.3%。引起SM和EMB同时耐药的分子模式,主要是rpsL 43联合embB 306,rpsL 88联合embB 497,rpsL 43联合embB 406和rpsL 88联合embB 306,分别占全部突变模式的52.1%、16.0%、10.5%和6.8%。见图2。

图2 结核分枝杆菌基因耐药相关突变率

3 讨论

本研究揭示了该地区高风险人群SM和EMB耐药模式及耐药相关的危险因素。该地区SM和EMB耐药率分别是18.4%和8.0%,低于青海省的40.9%和30.3%[6],而高于山东省的14.7%和2.6%[7]。2019—2021年期间SM-R和EMB-R的检出率均有下降趋势。这说明近几年来该地区在结核病督导短程化疗DOTS战略上的总体布局是有成效的。

第5次结核耐药的全国调查报告显示,初诊病例SM和EMB的耐药率分别为27.7%和4.9%,复治病例耐药率分别是37.2%、17.2%[8],而在该地区SM和EMB的初诊耐药率分别是17.3%和7.4%,复诊耐药率则是25.8%和12.1%。该地区初诊耐药率从2019—2021年有下降趋势,但初诊群体中EMB的耐药率依旧高于全国水平,说明仍需要通过加强结核患者的管理,降低耐药率。该地区复诊耐药率明显高于初诊个体,且近3年来SM-R检出率呈现升高趋势(25.0%、19.4%、32.0%),提示该研究仍需要加强服药依从性宣传及管理,另外由于MTB药敏结果耗时较长,临床对于结核患者的初期治疗更加依赖于经验性用药,这也在一定程度上增加了结核杆菌的获得性耐药,因此基层地区急需要更快速、更准确的药敏检测手段辅助临床精准抗结核。

乡村HRM检出率却远低于城市,这可能是因为医疗水平的差异,乡村在对高风险结核病例的初筛的确定性上有待进一步考证。城镇群体SM和EMB耐药率均高于乡村,这说明城市是耐药结核的高负担地区。结核是聚集性传染病,特别容易在高密度人群中播散。而城市人口密度相对较大,流动性强,而且因为医疗水平等差异可能会使得疑难、复杂结核感染病例更加向城市集中。另外据研究[9]表明,高精神压力和低身体质量指数是结核感染的独立危险因素。

虽然该地痰涂阴性群体的SM及EMB耐药率均高于痰涂阳性群体,但只有EMB-R在痰涂阳性和痰涂阴性群体之间差异显著,多因素回归模型中痰涂阴性对结核耐药风险增加的OR值比较接近于1,所以痰涂结果是否作为结核耐药的危险因素,还有待在扩大标本量且排除抽样偏倚等因素下再进一步考证。

多因素回归模型显示,男性、结核治疗史、年龄<51岁及城市分布均是导致SM-R及EMB-R风险增加的因素。有学者表示结核耐药风险与性别密切相关[10],有报道[11]则称结核耐药与性别无关。在该研究中,虽然男性对SM和EMB的耐药率均高于女性,但其耐药差异均无统计学意义,因此,性别是否能使结核耐药风险增加,还需要进一步实验数据的支持。SM和EMB耐药率均出现在年轻的群体中(SM-R 31～35岁,EMB-R 21～25岁),年龄<51岁群体耐药率高于年龄>50岁的群体,且年龄<51岁对SM-R和EMB-R的检出均是危险因素,这与之前的研究[12]一致,但与安徽省及台湾地区的耐药性的年龄类别不一致[11,13],这说明通常被认为是低危人群的年轻人可能需要额外的耐药结核检测。该研究中由于年龄<15岁和年龄>85岁群体的结核耐药性数据过少,该课题组将在今后的研究中进一步探究。

该地区SM耐药机制复杂,其主要是rpsL 43和 rpsL 88突变引起的,其次是rrs 905～908,这与国内其他地方的报道[14]相似,另外还有部分SM-R是由rpsL联合rrs突变引起,尤其是集中在rpsL 43、88位密码子和 rrs 905～908位点的联合突变。临床上通常将embB 306作为 EMB 耐药诊断标志物。在该地引起EMB-R的分子基础主要是embB 306和embB 406的单基因突变,这与一些研究[15-16]结果相似。了解和阻断rpsL 43、rpsL 48、rrs 905～908和embB 306的突变规律及传播机制,对于阻止结核耐药的发生及扩散都是十分重要且必须的。

该研究是首次较大范围揭示该地区结核耐药的分子基础,可为后期探究耐药结核的分子生物标志或者基因筛选提供初始数据,另外对该地区结核病尤其是耐药结核病的防治具有重要意义。研究未通过基因测序来进一步确认HRM检测到的单个核苷酸突变多态性或与耐药相关的多个突变的准确性,该课题组会在今后的研究中继续探明。