外泌体转运miR-223改善创伤性脑损伤的作用和机制

孙衍昶,徐鹏翔,何青龙,欧阳一彬,莫业和

创伤性脑损伤(traumatic brain injury,TBI)是指由钝性、穿透力、加速力或减速力等外部物理力量引起的颅脑损伤[1]。当发生TBI后,激活的小胶质细胞迅速迁移到损伤部位并释放大量炎症因子,破坏血脑屏障并诱导神经元凋亡,进一步加剧脑组织损伤[2-3]。因此,适当抑制小胶质细胞活化能减少TBI后的脑组织病理损害。外泌体(exosome,Exo)是具有脂质双层膜结构的微小囊泡,由于其体积小,可有效避免单核巨噬细胞的吞噬作用,并自由穿过血管壁和细胞外基质,因此可作为传递载体将信号分子运转至其他细胞,以影响或调控相关功能[4-5]。作为小的非编码RNA分子,miRNA通过与靶标mRNA 3′UTR区域配对结合进行转录后调控。现已知多种miRNA在TBI后异常表达并参与调控病理进程[6-7]。研究[8]表明,miR-223在脑损伤后表达异常,提高其表达可以抑制炎症反应,减轻脑组织损伤并减少神经元凋亡。基于此,该研究旨在明确Exo转运miR-223对TBI大鼠脑组织病变与小胶质细胞激活的影响,并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1实验动物 40只Sprague Dawley雄性大鼠,SPF级,体质量200～220 g,购自海南药物研究所有限责任公司[许可证号:SCXK(琼)2020-0007],饲养在通风良好、温度20～25 ℃、相对湿度50%～60%、光照/黑暗12 h循环的标准化动物饲养房内。动物饲养7 d后检查无异常即可用于实验,本研究方案经海南医学院第二附属医院伦理委员会批准(伦理批准号:H20220124-1)。

1.1.2主要试剂 HEK293细胞(美国ATCC细胞库),DMEM 培养基、胎牛血清及青-链霉素双抗液(美国Gibco公司),Lipofectamine 2000试剂盒(美国Invitrogen公司),TRIzol(日本TaKaRa公司),MicroRNA反转录与定量检测试剂盒(美国Applied Biosystems公司),通用型外泌体提取试剂盒(江苏凯基生物公司),RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、ECL超敏发光液及DAPI染料(上海碧云天生物研究所),HE染色液(北京百奥博莱生物公司),Nissl染色液(北京索莱宝生物公司),血清肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)、白细胞介素-6(interleukin-6,IL-6) ELISA检测试剂盒(上海酶研生物科技公司),Triton X-100(北京凯诗源生物科技公司),兔抗CD9多克隆抗体、兔抗CD63多克隆抗体、兔抗CD81多克隆抗体、兔抗Nod样受体蛋白3(nod-like receptor family pyrin domain containing 3,NLRP3)多克隆抗体、兔抗凋亡相关斑点样蛋白(apoptosis-asociated speck-like protein containing,ASC)多克隆抗体、兔抗半胱氨酸蛋白酶-1(Caspase-1)多克隆抗体、小鼠抗离子钙接头蛋白(ionized calcium binding adaptor molecule 1,Iba-1)单克隆抗体、兔抗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)多克隆抗体、辣根过氧化物酶标记的二抗与异硫氰酸荧光素标记的二抗(英国Abcam公司),miR-NC质粒与miR-223 mimic质粒交由广州锐博生物技术公司设计构建。

1.2 方法

1.2.1细胞培养与转染 将冷冻的HEK293细胞复苏,添加DMEM 培养基(含10%胎牛血清与1%青-链霉素双抗液)后置于37 ℃、5%CO2环境下传代培养。将对数生长期的细胞按照1×105个/孔的密度接种至6孔板,过夜培养,分为3组:对照组、miR-NC组、miR-223组。对照组细胞正常培养不处理,miR-NC组与miR-223组按照Lipofectamine 2000试剂盒使用说明书步骤,分别转染miR-NC质粒、miR-223 mimic质粒至细胞,转染6 h后更换为完全培养基,继续培养48 h,收集细胞。

1.2.2实时荧光定量PCR TRIzol法提取总RNA,1%凝胶电泳检测RNA质量,紫外分光光度计测定RNA浓度并记录A260/A280值。选择A260/A280值在1.8～2.1的RNA样品,按照TaqMan MicroRNA Reverse Transcription试剂盒说明书步骤进行逆转录反应。再以第一条cDNA链为模板,通过实时荧光定量PCR反应测定miR-223表达水平,具体根据TaqMan MicroRNA assay试剂盒说明书配制反应体系,在定量系统上设置程序进行扩增,以U6作为内参基因进行标准化,引物序列如下:miR-223上游引物5′-CGCUAUAUCUUUUAUAUAUA-3′,下游引物5′-CGCUAUCUUUCUAUUAUGACUCCAUAA-3′;U6上游引物5′-GTGCTCGCTTCGGCAGCACATA-TAC-3′,下游引物5′-AAAAATATGGAACGCTTCAC-GAATTTG-3′。反应结束后,采用比较循环阈值2-ΔΔCt法计算样本内miR-223相对表达量,实验重复3次。

1.2.3Exo的提取与鉴定 提取:PBS洗涤转染后的细胞,将其置于高速低温离心机中以4 ℃、3 000 r/min离心10 min,取上清液,移至干净离心管;加入250 μl Exo分离试剂,轻轻混匀,4 ℃下静置2 h,再以8 500 r/min离心30 min,弃去上清液,留沉淀,加入无菌PBS重悬,获得Exo悬液,保存于-80 ℃中。鉴定:吸取10 μl Exo悬液滴入载样铜网上,室温吸附10 min,吸弃多余液体,滴加2%醋酸双氧乙铀溶液染色1 min,吸弃剩余染色液,自然晾干,将载样铜网置于样品室内,通过透射电子显微镜观察Exo形态并摄取图像。采用纳米颗粒跟踪分析对Exo的布朗运动进行追踪和分析,以计算直径和浓度。收集提取的Exo,Western blot测定Exo标志蛋白CD9、CD63及CD81表达情况,并通过实时荧光定量PCR测定miR-223的表达水平。

1.2.4Western blot 在Exo或脑组织中添加RIPA裂解液,提取总蛋白,BCA法对样品进行定量。100 ℃水浴煮沸使蛋白变性,室温冷却后,保存于-20 ℃。配置10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶,固定电泳装置,向电泳槽注入电泳缓冲液,取等量蛋白样品上样至凝胶孔内,选择适当电压进行电泳分离蛋白。结束后,将分离的蛋白转印至NC膜上,浸入5%脱脂奶粉溶液中室温封闭1 h。Exo鉴定中以兔抗人CD9、CD63、CD81多克隆抗体作为一抗(1 ∶1 000),细胞测定中兔抗人NLRP3、ASC、Caspase-1多克隆抗体作为一抗(1 ∶1 000),将膜与稀释的一抗液置于4 ℃下共孵育过夜。次日,TBST洗膜,加入对应二抗(1 ∶5 000),室温孵育1 h,TBST清洗后,ECL超敏发光液发光显影,观察蛋白条带,并通过Image Pro Plus软件分析细胞内蛋白条带灰度值,以GAPDH作为标准化内参蛋白,计算目的蛋白的相对表达量。

1.2.5TBI大鼠模型制备与分组处理 将40只大鼠按照随机数字表法分为假手术组、模型组、NC-Exo组、miR-223-Exo组,每组10只。参考文献[9],根据改良Feeney自由落体法制备TBI大鼠模型,将除假手术组外的其余3组大鼠通过腹腔注射10%水合氯醛麻醉,俯卧位固定于手术台上,全身消毒,头部备皮,沿大鼠颅骨正中线作一纵切口,完整暴露右侧颅骨,于矢状缝旁开3 mm位置应用颅骨钻制作直径约5 mm的骨窗,将40 g砝码自上方25 cm高度自由落下,撞击脑组织,制备TBI大鼠模型,随后止血并缝合。假手术组除不进行撞击操作外,其余操作相同。造模结束后,NC-Exo组和miR-223-Exo组大鼠分别通过尾静脉注入转染miR-NC质粒、miR-223 mimic质粒细胞来源的Exo(3×109个微粒),假手术组和模型组同时尾静脉注射等量PBS溶液。

1.2.6HE染色 2周后,颈椎脱臼法处死各组大鼠,在冰盘上分离脑组织,清洗干净后,置于4%多聚甲醛中固定过夜。将固定好的脑组织经二甲苯透明和梯度乙醇溶液水化,OCT包埋,制备成4 μm厚的切片。切片进行脱水与透明,苏木精染色5 min,流水冲洗,1%盐酸/乙醇溶液中分化数秒,流水冲洗,氨水返蓝,伊红染色3 min,再用梯度乙醇溶液脱水,二甲苯透明,滴上中性树胶覆盖组织,封片,自然晾干,在光学显微镜下观察脑组织病理学变化并拍摄图像。

1.2.7Nissl染色 取制备的大鼠脑组织病理切片,二甲苯透明,梯度乙醇水化,加入Nissl染色10 min,蒸馏水洗涤,无水乙醇处理,二甲苯透明,滴上中性树胶覆盖组织,封片,自然晾干,在光学显微镜下观察脑组织染色情况并拍摄图像,尼氏体呈淡紫蓝色。

1.2.8ELISA法 2周后,各组大鼠经腹主动脉取血,室温静置2 h,以4 000 r/min 4 °C离心10 min,获得上清液。采用ELISA法对血清样本中TNF-α、IL-1β、IL-6水平进行测定,操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.2.9免疫荧光双染法 取制备的各组大鼠脑组织切片,使用含有0.3%Triton X-100的PBS溶液浸泡透膜,冷丙酮固定10 min。滴加适量5%牛血清白蛋白溶液,室温封闭30 min。弃去原液,滴加兔抗NLRP3多克隆抗体(1 ∶100)与小鼠抗Iba-1单克隆抗体(1 ∶100),进行双荧光标记,置于4 ℃孵育过夜。PBS清洗切片3次,每次5 min。滴加异硫氰酸荧光素标记的二抗(1 ∶500),室温孵育1 h。PBS再次清洗切片,DAPI避光染核10 min,抗荧光淬灭封片剂封片,激光扫描共焦显微镜下观察脑组织染色情况并拍摄图像,通过Image Pro Plus软件分析蛋白染色的荧光强度。

2 结果

2.1 细胞转染效果细胞转染结束后,实时荧光定量PCR测定结果显示,3组细胞中miR-223相对表达量差异有统计学意义(F=49.850,P<0.001)。miR-223组细胞中miR-223相对表达量显著高于对照组和miR-NC组(P<0.05),见图1。

图1 实时荧光定量PCR测定转染后细胞中miR-223表达变化

2.2 Exo鉴定结果在透射显微镜下观察到分离的颗粒物为球形囊泡,类似圆形小碟状,由脂双层密封,见图2A,粒径峰值大约处于120 nm,见图2B;Western blot检测结果显示,Exo标志蛋白CD9、CD63及CD81均明显高表达,见图2C,以上结果说明成功分离到Exo。此外,经实时荧光定量PCR测定发现,3组Exo中miR-223相对表达量差异有统计学意义(F=42.205,P<0.001),miR-223组的miR-223相对表达量显著高于对照组与miR-NC组(P<0.05),见图2D,说明成功获得高表达miR-223的Exo。

图2 Exo鉴定

2.3 Exo转运miR-223改善TBI大鼠脑组织病理损伤通过HE染色观察到假手术组大鼠脑组织内细胞形态规则,大小较为一致,胞质染色均匀;模型组大鼠脑组织间质水肿,细胞形态不规则,胞体肿胀或胞核皱缩、碎裂,且胞核呈深染色;与模型组比较,NC-Exo组大鼠脑组织损伤现象未得到明显改善,而miR-223-Exo组大鼠脑组织间隙变小,细胞碎裂或胞核皱缩数目减少,损伤程度明显减小。

经Nissl染色后可见假手术组尼氏体染色均匀,细胞结构清晰且分布均匀,数目较多;模型组大鼠尼氏体排列紊乱,出现坏死与胞核固缩、溶解的现象,数目也明显减少;与模型组比较,NC-Exo组大鼠尼氏体仍表现为损伤,未发生明显改变,miR-223-Exo组大鼠尼氏体数量明显增加,细胞形态恢复正常,见图3。

图3 HE染色和Nissl染色观察各组大鼠脑组织病理学变化 ×200

2.4 Exo转运miR-223抑制TBI大鼠血清TNF-α、IL-1β及IL-6水平ELISA法测定4组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平,结果显示,各组间TNF-α、IL-1β、IL-6水平差异有统计学意义(F=426.975、559.172、299.013,P<0.001)。模型组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均高于假手术组(P<0.05);与模型组比较,miR-223-Exo组大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均降低(P<0.05),NC-Exo组血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平差异无统计学意义(P>0.05),见表1。

表1 各组大鼠血清内细胞因子水平比较

2.5 Exo转运miR-223抑制TBI大鼠脑组织NLRP3与Iba-1荧光表达4组大鼠脑组织切片经免疫荧光染色后显示,NLRP3与Iba-1的荧光染色强度差异有统计学意义(F=56.117、60.346,P<0.001)。与假手术组比较,模型组大鼠脑组织内NLRP3与Iba-1的荧光染色强度显著增加(P<0.05);与模型组比较,miR-223-Exo组大鼠脑组织内NLRP3与Iba-1的荧光染色强度显著减少(P<0.05),NC-Exo组内两者的染色强度差异无统计学意义(P>0.05),见图4。

图4 免疫荧光染色观察各组大鼠脑组织NLRP3与Iba-1表达 ×100

2.6 Exo转运miR-223抑制TBI大鼠脑组织内NLRP3炎症小体途径相关蛋白表达Western blot测定4组大鼠脑组织内NLRP3、ASC及Caspase-1蛋白表达水平,结果显示,各组间NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白相对表达量差异均有统计学意义(F=28.546、47.051、41.359,P<0.001)。与假手术组比较,模型组大鼠脑组织内NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白相对表达量均显著上调(P<0.05);而与模型组比较,miR-223-Exo组大鼠脑组织内NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白相对表达量均显著下调(P<0.05),NC-Exo组与模型组大鼠脑组织内NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白相对表达量差异无统计学意义(P>0.05),见图5。

图5 Western blot测定各组大鼠脑组织内NLRP3、ASC及Caspase-1蛋白表达

3 讨论

既往研究表明,miRNA表达水平改变与TBI密切相关,例如,已在TBI大鼠脑组织中miRNA-21-5p表达水平增加,上调miRNA-21-5p表达可以通过抑制炎症反应和减少细胞凋亡来缓解受损脑微血管内皮屏障的泄漏,改善大鼠神经功能障碍[10];在TBI小鼠中上调miRNA-23a-3p表达能够抑制皮质神经元凋亡并改善神经功能,有效减轻TBI小鼠脑组织病理损伤[11];上调miRNA-9-5p表达通过激活Hedgehog通路和抑制NF-κB/MMP-9通路来缓解血脑屏障损伤和神经炎症反应,从而促进TBI后神经功能的恢复[12]。目前,关于miR-223在各种脑损伤的研究报道也不断增多,Sha et al[13]研究表明电针灸治疗显著降低了缺血性脑损伤大鼠的神经功能缺损评分和脑梗死面积,并揭示这一作用是通过提高梗死皮质组织中miR-223表达水平实现的;Huang et al[14]研究发现在出血后丘脑痛小鼠模型中miR-223表达下降,注射miR-223 agomir能够抑制炎症因子表达,并改善丘脑出血诱导的中枢性中风疼痛;Zhao et al[15]研究指出miR-223-3p能够通过抑制小胶质细胞激活后介导的促炎反应,从而减轻大脑中动脉闭塞再灌注大鼠脑组织损伤。以上研究结果均提示,miR-223具有成为TBI诊断及治疗靶标的潜力。

Exo具有生物相容性好、免疫原性低、稳定性高和能够穿越血脑屏障等特点,因而将其作为药物或分子递送载体在包括脑疾病在内的靶向治疗中独具优势[16-17]。以Exo作为载体运转miRNA可以改变脑组织结构及功能,这为TBI的治疗提供新途径。高迎吉 等[18]研究表明Exo能够通过递送miR-124抑制急性创伤性脊髓损伤大鼠脊髓小胶质细胞活化,减轻炎症反应,从而对大鼠起到保护作用;Long et al[19]研究指出星形胶质细胞来源的Exo能够通过运转miR-873a-5p抑制NF-κB信号通路,减弱小胶质细胞介导的神经炎症并改善了TBI后神经缺陷;Zhang et al[20]研究表明富集miR-17-92的Exo能够传递miR-17-92至TBI受损组织,从而改善运动和认知功能障碍,减少神经炎症和增强内源性血管生成,并抑制神经元丢失。本研究结果显示,经Exo转运miR-223处理的TBI大鼠脑组织损伤明显减轻,尼氏体数量增加且细胞形态趋于正常,这表明Exo转运miR-223能够有效改善TBI大鼠脑部病理损伤。

TBI分为两个阶段,第一阶段为原发性损伤,特征是血脑屏障改变和破坏,血流量减少以及对神经元和神经胶质细胞的直接损伤。第二阶段为继发性损伤,发生在损伤后几分钟、几小时、几个月甚至几年内,神经炎症反应在该阶段起核心作用,引起细胞变性以及神经/突触传递和可塑性的改变[21]。神经炎症反应过程较为复杂,包括小胶质细胞和外周中性粒细胞活化、淋巴细胞和巨噬细胞浸润、促炎和抗炎细胞因子释放以及免疫细胞募集,其中,小胶质细胞激活后诱导促炎细胞因子如TNF-α、IL-1β和IL-6的产生,导致神经系统症状和神经功能障碍[3,22]。NLRP3是参与TBI中神经炎症反应的主要成分之一,TBI发生后受伤脑皮层中NLRP3炎症小体复合物形成增加,其激活被认为是TBI后初始组织损伤扩增的主要原因[23-24]。作为神经炎症信号通路的重要靶点,靶向抑制NLRP3炎性小体的形成和激活是TBI的前瞻性疗法。已有研究表明miR-223能够调控NLRP3的表达水平及其相关途径的激活,从而调控炎症性损伤,例如,miR-223-3p能够抑制梅毒螺旋体诱导的血管内皮细胞中NLRP3炎性小体活化,这为梅毒提供潜在的治疗靶点[25];miR-223-3p可能通过靶向牙周炎中的NLRP3来调节GSDMD介导的神经凋亡,并抑制NLRP3下游炎症介质IL-1β和IL-6的分泌[26];miR-223通过直接结合到NLRP3的3′-未翻译区域来抑制其表达,并降低慢性坐骨神经损伤小鼠脊髓中NLRP3、ASC、Caspase-1、IL-1β和IL-18的蛋白表达水平,增加了M2型巨噬细胞的比例,从而改善慢性坐骨神经损伤小鼠的神经性疼痛[27]。本研究结果显示,经Exo转运miR-223处理的TBI大鼠血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平降低,脑组织中小胶质细胞标志物Iba-1与NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表达均下降,由此说明,Exo转运miR-223能够抑制小胶质细胞激活与NLRP3炎性小体活化,从而降低TBI大鼠神经炎症反应。

综上所述,Exo转运miR-223能够减轻TBI大鼠脑部病理损伤,抑制小胶质细胞激活与炎症反应,该作用可能与抑制NLRP3炎性小体活化有关,本研究为TBI的治疗提供了新思路。但在此过程中miR-223调控的具体靶标或相关信号通路尚不清楚,有待后续进一步探索。