甘薯茎腐病田间症状识别与快速镜检诊断研究

张莉丽，王 丽，谢关林，余山红

（1浙江省杭州市农业技术推广中心，杭州 310021；2浙江大学生物技术研究所，杭州 310058；3浙江省台州市农业科学研究院，浙江台州 317000）

0 引言

中国是世界第一甘薯生产国，对影响产量和品质的病害备受关注。甘薯茎腐病是中国2010年新报道的一种重要细菌病害[1]，目前在福建、广东、河北、江西、广西、海南、河南、重庆、江苏（区）有发现[2-3]，已成为中国危害最重的甘薯病害之一。杭州市农业技术推广中心植保站于2015年5月首次在浙江省发现该病害并请浙江大学植物细菌实验室作了病原鉴定，明确了甘薯茎腐病是由Dickeya dadantii引起(Syn.Erwinia chrysanthemi)，从此浙江省的甘薯茎腐病研究与防控拉开序幕。由于甘薯在浙江省的重要地位，甘薯茎腐病于2016年被浙江省列入植物检疫性有害生物补充名单。

作为植物检疫性有害生物，产地检疫是必须的，而产地检疫对病害的典型症状及快捷的田间病害诊断特别重要，然而，国内对病害鉴定及病原的检测均是借助高档仪器的分子检测及专业人员[4-7]，但作为地、县植保植检站根本不具备这些条件。为此，自2015—2019年连续5 年笔者对田间病害的症状作了深入细致的观察，并对病原作了进一步的研究。发现了一些国内外没有被仔细描述的病害初期症状特征，同时提出了快捷的症状结合光学显微镜镜检法，为甘薯细菌性茎腐病的快速产地检疫及适时防控找到一条可行的途径。

1 材料与方法

1.1 标准菌株

供鉴定用2株标准对照细菌菌株Dickeya dadantiiLMG 2534 和D.dadantiiLMG 2804(Syn.Erwinia chrysanthemi)由比利时根特大学国际菌种保藏中心Swings 教授提供；D.dadantiiCZ15001,D.dadantiiCZ15002由浙江大学植物细菌实验室提供。

1.2 病害田间症状观察与记录

在杭州地区甘薯茎腐病发病高峰期的5月上中旬及9月上中旬，选择历年发病较重的田块，记录田间小气候的温湿度，每天定点观察病害的发生发展情况，与国内外记录的病害症状描述作比较，拍照留存。对国内外没有记载的病害症状除拍照外，采样带回实验室进一步鉴定，对典型的甘薯茎腐病症状样本只作茎、叶及叶柄上的喷菌现象观察。对国内外没有症状记录的样本或不典型的样本除喷菌现象观察外，还作病原的分离鉴定。

1.3 甘薯组织的光学显微镜检

取一块干净的载玻片，在中间滴1 滴无菌水。甘薯病叶样本用灭菌刀片直接切取6 mm×2 mm组织；甘薯病叶柄直接切取6 mm段，中间切开；甘薯病茎直接横切茎部1 mm厚，包含木质部和韧皮部；分别将所取组织放入水滴中。先将盖玻片的一侧触到水滴，盖上盖玻片后轻轻按压，如组织较厚实，可从盖玻片边缘酌量滴入少许水，使所观察组织在盖玻片下充分浸润，用吸水纸吸干载玻片上多余的水。把做好的切片放在低倍显微镜下观察，将切片上的感病组织置于光源投射的中心，灯光不宜过亮，移动到病组织边缘，观察喷菌现象，即云雾状细菌菌体（细菌溢）。

1.4 烟草过敏反应及致病性测定

烟草过敏反应(HR)采取背面注射法将菌液接种于本氏烟叶片上，28℃培养，24 h后观察结果。致病性测定采用针刺法将菌液接种于扦插成活的健康甘薯植株茎基部，套袋保湿，置30℃光照培养箱中，3 d后开始观察发病情况。

1.5 脂肪酸(FAMEs)分析

将在NA 培养基上生长24 h 的2 株甘薯茎腐病致病代表菌CZ15001、CZ15002 及2 株标准对照菌株，转接到含3%胰蛋白酶的TSBA培养基上继续培养24 h，然后每菌挑取约40 mg 的菌体，经过皂化、甲基化、萃取、洗涤过程获取脂肪酸样品[8]。脂肪酸鉴定采取全自动微生物鉴定系统——美国Agilent 6890 型气相色谱系统。鉴定结果通过专化的微生物鉴定系统软件——美国MIDI 公司开发的基于细菌脂肪酸成分鉴定细 菌的MIS4.5(microbial identification system) 和LGS4.5(library generation software)获得。

1.6 病原的16SrDNA序列测定

病原菌基因组的提取及16S rDNA 序列测定，根据细菌16S rDNA 基因的通用引物[6,9]：F5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3/R5’ -ACGGTTACCTTGTTACGACTT-3’。对病原基因组进行PCR扩增。反应体系为50 μL，反应条件为94℃，4 min；94℃，0.5 min；62℃，0.5 min；72℃，1.5 min；30个循环；72℃，10 min。PCR产物在1.0%的琼脂糖凝胶电泳上检测后，用AxyPrepTMDNA Gel Extraction Kit回收纯化，由华大基因公司测序。

2 结果与分析

2.1 甘薯茎腐病田间症状识别

甘薯茎腐病在甘薯播种到收获的各个时期均可发生，主要侵害甘薯的根、茎和叶柄，严重时叶片亦被感染。杭州地区5月上中旬和9月上中旬是反季甘薯病害发生的最适时期，甘薯苗期或扦插成活后一个多月内，此时常遇30～32℃的发病适宜温度及80%以上的高湿，薯苗茎部自下而上突现水渍状暗褐至黑色软腐（图1A），发病茎部最前端及叶柄上可见暗褐色条状或波状水渍状斑（图1B），腐烂处有恶臭、无菌脓，最后全株迅速枯亡（图1C）。病害症状从始发至全株死亡一般在1 星期左右。在适温和高湿条件下，有时可见甘薯叶片和叶柄上的水渍状病斑（图2A），但在阳光下随叶片水分的蒸腾作用而马上消失，因整株的颈部腐烂发生几乎与叶片上的水渍状病斑同时发生（图2B），紧接着叶片和叶柄上的水渍状病斑干燥即转成黑色干枯斑（图2C），最后整株枯死。杭州地区一般在6月上旬后和9 月中下旬后田间温度不稳定，有32℃以上的高温和25℃以下的低温，而且湿度常低于70%，此时病害发生缓慢，随着甘薯藤蔓不断延长，匍匐在地上的藤蔓节上长出大量的不定根，被甘薯茎腐病菌感染的藤蔓茎部出现深褐色病斑（图3A），由于湿度不是很高，茎部没有马上腐烂，有的病茎可一直维持到收获期，呈现深黑色，干燥时病茎常出现纵裂；发病较轻的结薯小或成须根（图3B）。田间收获前，甘薯块根受感染常出现大块黑斑（图3C），切开后亦能见到深褐至黑色斑（图3D）。

图1 甘薯茎腐病田间自然发病症状

图2 甘薯茎腐病田间自然发病的叶子和叶柄发病的症状

图3 甘薯茎腐病田间自然发病的根茎部及薯块发病的症状

2.2 光学显微镜镜检

2.2.1 甘薯细菌性茎腐病镜检的最佳部位 在甘薯茎腐病初发病、中度发病和重度发病期，通过对茎、根、叶、叶柄各30 份以上样本的显微镜镜检发现：初发病期，即茎部的水渍状斑始现时，根、叶、叶柄部难以见到细菌溢，但茎部能清楚观察到喷菌现象（表1）；中度发病时，除了茎部外，根部也观察到喷菌现象，但在叶、叶柄部仍难见到；重度发病时，茎、根部能见喷菌现象，叶、叶柄部只有在其上显现茎腐病病斑时才能见到喷菌现象，一般情况下，叶、叶柄部难以见到喷菌现象。通过对茎、根、叶、叶柄部位的镜检研究表明，茎部是显微镜镜检的最佳部位。

表1 甘薯植株不同部位的甘薯茎腐病细菌溢显微镜镜检结果

2.2.2 甘薯细菌性茎腐病镜检的最佳时期 上述研究明确了甘薯茎部是茎腐病菌聚集最多的地方，是镜检的最佳部位。但镜检的最佳时期在什么时候？从植物检疫和防控的角度看，当然是越早越好，但必须考虑其有效性。由图4我们发现甘薯茎腐在田间发生有明显的发病中心，发病初期呈零星点状分布，在初发病期甘薯病组织中会增殖大量的细菌，但尚无明显症状，在清晨露水尚未散去前，可以从甘薯茎基部观察到水渍状斑（图4A）。通过对甘薯茎部306份样本的镜检表明，甘薯茎腐病初发病期的茎基水渍状斑始现时，是镜检最佳和最有效时期，此时观察到的喷菌现象非常清晰（图4A、图4B）。当把病茎横切面碾碎时，在低倍显微镜下能观察到大量的溢出的细菌（图4C）。

图4 甘薯茎腐病病茎初期症状的显微镜喷菌现象观察

2.2.3 与其他甘薯茎基部腐烂病的区别 通过对306份甘薯茎腐病症状识别和显微镜镜检，我们能准确地诊断甘薯茎腐病。同时还能区分田间常见的真菌性甘薯茎基部腐烂病菌（图5A），从图5左边类似甘薯茎腐病的病样中，未镜检到细菌的喷菌现象，但能从茎部的横切面镜检到大量的镰刀菌(Fusariumsp.)大小分生孢子（图5B），在80%这类样本中能检测到镰刀菌，但有20%的样本中检测到交链孢子或其他真菌孢子[10]。这表明在杭州地区的茎基部腐烂菌除了甘薯茎腐病细菌外，主要是镰刀菌[11]。

图5 非茎腐病菌引起的甘薯病茎及显微镜观察

2.3 光学显微镜镜检结果的验证

对50 份病茎有喷菌现象的样本做了分离鉴定，这些样本中均能分离出D.dadantii病菌，两者的符合率达100%；50 份病茎有喷菌现象的样本经病菌分离后做了烟草过敏反应，它们均表现为阳性反应；50 份病茎有喷菌现象的样本做了致病性测定，将它们接种于甘薯幼苗，症状与田间的基本一致，5～6 d 后全株腐烂、萎蔫死亡，49 份具有致病性，有一个样本不发病，可能由于接种浓度偏底或病菌的致病力太弱，符合率为98%；30份病茎有喷菌现象的样本样做了脂肪酸分析，相似性系数接近或超过标准菌D.dadantiiLMG2534 和D.dadantiiLMG 2804 有30 份，符合率100%；30份病茎有喷菌现象的样本做了PCR分析，结果与2 株甘薯茎腐病标准菌株和2 株菌(D.dadantiiCZ15001,D.dadantiiCZ15002)同源的30 份，符合率100%。这些都表明甘薯茎腐病症状识别加显微镜镜检的喷菌现象与这些传统和分子生物学方法匹配的准确率在98%以上。（表2）。

表2 甘薯茎腐病病茎显微镜镜检结果的验证

3 讨论

甘薯茎腐病初期症状识别加显微镜镜检喷菌现象的方法是我们在多年的甘薯茎腐病植物检疫中摸索出来，用于产地检疫的一种新方法，国内外没有这方面的报道。初期症状识别是植物病害检疫常用的传统方法，但至今没有人与这最经典的植物细菌喷菌现象结合起来用于产地检疫的报道。本研究除了明确显微镜镜检喷菌现象检查的最佳时期和最佳部位外，还把这种方法与传统的和分子生物学方法进行了比较。发现这是一种植物病害产地检疫中准确、快捷、简便的好方法。根据只要是植物细菌病害就能通过显微镜检查到喷菌现象，而非细菌病害没有这种现象这一植物细菌学原理。首先可以轻松地排除甘薯上多种病原真菌引起的病害，如甘薯茎基（枯）腐病，它可以由尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)、极细链格孢(Alternaria tenuissima)和齐整小核菌(Sclerotium rolfsii)引起[10-11]；也可以由拟轮枝镰孢菌(F.verticillioides)、腐皮镰刀菌(F.solani)、尖镰刀菌(F.oxysporum)、性拟茎点霉(P.destruens)和爪哇镰孢(F.javanicum)、甘薯间座壳菌(Diaporthe batatas)等6 种病原真菌引起[12-14]；据巴西2021年的报道，甘薯茎基（枯）腐病除了中国报道的病原真菌外还可以由其他病原真菌引起[15]。除了不少的病原真菌引起甘薯茎基（枯）腐病外，在中国北方的腐烂茎线虫(Ditylenchus destructor)可在甘薯茎部引起甘薯茎线虫病[16]，而南方的根结线虫(Meloidogynespp.)在广东省引起甘薯根结结线虫病[17]。通过镜检喷菌现象我们能轻松地排除这些众多的甘薯茎基部真菌和线虫病。但如镜检到喷菌现象，我们只能知道它是细菌病害，无法知道它是哪一种细菌病害。到目前为止从国内甘薯上分离到的病原细菌除了甘薯茎腐病菌(Dickeya dadantii) 外，还有甘薯瘟菌(Ralstonia solanacearum)[18-20]、巴西果胶杆菌(Pectobacterium brasiliense)[21]和瓜类果斑病菌(Acidovorax citrulli)[22]。但真正在国内田间流行的甘薯细菌病害只有甘薯茎腐病和甘薯瘟病，而后两种病原细菌只是碰巧分离到，而且已经证实了瓜类果斑病菌不引起甘薯细菌病害[23]；巴西果胶杆菌在田间引起甘薯茎腐病也有待进一步验证。目前国内已被证实并流行的甘薯细菌病害只有甘薯茎腐病和甘薯瘟病。虽然2种病害通过镜检喷菌现象无法区别，但可以通过初期的症状识别借以区分，甘薯瘟病苗期发病叶尖稍萎蔫、维管束变黄，后变褐色；成株期感染子叶萎蔫，根变细，小薯块与茎基部变色、腐烂，轻拔易断[24-25]。然而，如前所述，甘薯茎腐病没有这些特征，可以通过症状识别与甘薯瘟病区分开。

根据前人的报道[26-27]，人工接种甘薯细菌性茎腐病菌在室内32℃高温加70%以上高湿，5 d后薯苗全株腐烂死亡；32℃高温时，如果湿度60%以下，病害发生明显减缓，10 d 后只见黑色病斑没有腐烂；27℃温度时，湿度60%以下，10 d后只见黑色病斑也没有腐烂；22℃温度下在各种湿度时，10 d 后无任何病斑。这表明适宜的温湿度是甘薯茎腐病发生的关键。这与笔者在田间观测到症状情况基本一致。在适宜的温湿度条件下，病害蔓延迅猛，甘薯茎腐病的田间自然发病症状从茎部水渍状出现至全株死亡，一般为一星期左右。其中32℃的适温及70%以上的湿度起了非常关键的作用，所以，根据甘薯茎腐病的症状特点，在防控上要及时发现苗期症状，在甘薯茎、叶柄和叶子的水渍状初现期开始用药保护，同时也是产地检疫的最佳时期。图2A的图片很珍贵，在国内外未见到这种叶部水渍状症状，因病害只在特别适宜的条件下才发生，发生的时间非常短，在高温高湿的雨后难得一见，但次日马上消失，紧接着叶片和叶柄上的水渍状病斑干燥即转成黑色干枯斑。甘薯茎腐的茎、叶柄和叶子的水渍状初现期非常短，在田间出现的时间就1～2 d。有效地掌握这一关键时期是甘薯茎腐防控的关键。如果这时送当地有关实验室鉴定检测最快需3 d，而3 d 后甘薯茎腐防控的最适时间已错过。但如果通过初期症状结合显微镜镜检10～20 min 就能知晓结果，不会耽误甘薯茎腐病的最佳防控时期。

最后需要指出的是任何一种检验检疫方法都不是十全十美的，有它的长处和短处，甘薯茎腐病的初期症状识别加显微镜镜检喷菌现象也一样，只要植物有病原细菌的症状表现，就能见到喷菌现象，没有假阳性，这是该方法的长处；但如果病菌在温湿度不适宜时不表现症状，而是潜伏侵染，这时植物组织内的细菌量很少，无法见到喷菌现象，就会误认为植株没有被侵染、是健康的，这就是这一方法的短处，它的灵敏度难以与分子生物学方法相比较。而分子生物学方法虽然灵敏度高，但如果所用引物的特异性不强或病菌已死亡或失活就有可能产生假阳性。所以，如果条件允许，甘薯茎腐病的初期症状识别加显微镜镜检喷菌现象这一方法与分子生物学方法相结合是最保险的组合，因前者是直观的，后者是灵敏的。

4 结论

自2015—2019年连续5年对田间甘薯茎腐病症状深入细致观察与不同时段发病症状的比较，发现甘薯茎腐病可以发生在甘薯植物的叶、叶柄、茎及块根上，但主要发生在茎基部。通过对甘薯茎部306份样本的镜检表明，甘薯茎腐病初发病期的茎基水渍状斑始现时，是镜检最佳和最有效时期。经对甘薯茎腐病发病轻、中、重的306 份茎部样本的镜检及与根、叶和叶柄各90份样本的显微镜镜检比较，明确了茎基部是显微镜镜检的最佳部位。甘薯茎腐病初期症状识别加显微镜镜检喷菌现象是植物病害产地检疫中准确、快捷、简便的好方法，它与分离鉴定、烟草过敏反应、致病性测定、脂肪酸分析、PCR测定比较的匹配准确率在98%～100%。