秦岭华中五味子种实性状变异与环境因子的关联研究

张姜岚，刘 宸，崔浪军，强 毅，陈清敏，王高红，郭 华

（1西北濒危药材资源开发国家工程实验室/药用资源与天然药物化学教育部重点实验室/陕西师范大学生命科学学院，西安 710119；2陕西省地质调查院，西安 710054）

0 引言

木兰科植物华中五味子(Schisandra sphenanthera)的干燥成熟果实在中药领域被称为南五味子，其作为一种集药用、食用、观赏为一体的林下木质落叶藤本植物[1]，具有良好的市场开发潜力。随着医药、保健新产品的研发[2-3]，市场对华中五味子的需求激增。陕西段秦岭是华中五味子天然分布区之一，根据走访调查，目前在陕西安康、汉中、宝鸡等地已发展起规模化的华中五味子人工栽培基地。但人工栽培多采用就地取材、无性扩繁的方式，逐渐出现了品质下降、产量降低、病虫害频发等一系列问题[4]。因此，在人工栽培中加大有性繁殖的比例，是推动华中五味子产业发展的当务之急，这就需要深入了解种源地华中五味子种实特性及表型变异规律。

针对华中五味子的研究主要集中在药用价值、化学成分[3,5-8]的研究上，关于其种实特性等遗传资源评价的研究相对较少。表型多样性是遗传与环境共同作用的结果，研究不同地理环境条件下的天然种群的表型性状分化程度和变异规律，不仅可在一定程度上反映其遗传变异水平，也可以有效揭示生物对不同环境的适应，进而探究其发展演化[9]。种实性状在物种自然演化过程中具有较高的遗传稳定性，不易受短期环境变化的影响[10]。同时，作为主要繁殖器官，种实性状对物种的定居、繁衍及分布具有重要影响[11]。研究表明，果实形态、种子大小、质量、种翅有无等都会影响其种子传播媒介（风、动物等）的传播效率，进而影响物种的分布范围[12]。

秦岭是中国重要的气候分水岭，南北坡气候差异显著[13]。不少研究表明，地区海拔、年平均气温和经纬度是影响种实表型性状变异的主要因素[14-15]。华中五味子在秦岭北坡（暖温带气候）和南坡（北亚热带气候）均有大量分布，分布区气候条件迥异，进化上较为保守的种实性状是否会在狭窄空间上产生相应变异有待研究。笔者对秦岭南、北坡分布的5 个种群开展种实性状分析，旨在揭示华中五味子种实性状在秦岭不同气候带上的表型分化和变异规律，并探究其与生境的关系，从而增加华中五味子生态种植的理论积累和技术储备，为药用植物的种质资源保护、引种繁育和栽培管理提供清晰的生态学背景，促进秦岭地区林药一体化产业的发展。

1 材料与方法

1.1 研究区域与样地概况

秦岭地处中国中部，是国内12个关键生态功能区之一。秦岭山区水热条件优越，地形变化复杂，相对海拔高差较大，植物种类丰富，森林群落类型多样，垂直分布明显。主要森林群落有低山落叶阔叶混交林、中山针阔混交林和亚高山针叶林。20 世纪七八十年代林区经历了大面积的人为采伐，现有的森林绝大部分为天然更新的次生林[16-17]。秦岭北坡属于暖温带半湿润气候，广泛分布暖温带落叶阔叶林。秦岭南坡水热条较好，气候随海拔变化多样，土壤类型较多，年降水量依海拔不同在830～970 mm，其南坡海拔800～1000 m等高线，是中国北亚热带常绿落叶阔叶混交林与暖温带落叶阔叶混交林的生态交错区[18-19]。

本研究华中五味子种子样品采集样地分别位于秦岭北坡宝鸡市太白县（暖温带）、秦岭南坡中段商洛市柞水县（暖温带-北亚热带过渡区）、汉中市宁强县（北亚热带），样地概况见表1。华中五味子果实样品采集样地分别位于秦岭北坡陕西省宝鸡市太白县（暖温带）、秦岭南坡中段陕西省商洛市柞水县、镇安县、山阳县（暖温带-北亚热带过渡区），陕西省汉中市留坝县、略阳县（北亚热带），陕西省安康市石泉县、汉阴县、岚皋县（北亚热带），样地概况见表2。实验于2020 年8月—2021年4月在陕西师范大学长安校区进行。

表1 种子样品采集样地概况

表2 果实样品采集样地概况

1.2 数据采集

1.2.1 种子及果实获取方式 种子获取方式参考文献[20]，采用水浮法。在华中五味子成熟期取当地成熟华中五味子果实，每个样地采集果串至少30串带回实验室进行后续数据采集及分析。

1.2.2 实验仪器与设备 实验中使用到实验仪器有扫描仪(EPSON Expression 12000XLJ3318)、烘箱（上海一横科学仪器DHG-9430A）、电子天平（sartorious）、超高效液相色谱仪（UPLC）（岛津SPD-20A）、直尺（得力）、游标卡尺（上海沪工）。

1.2.3 数据采集方法

（1）种子数据采集方法。

①种子表观数据采集方法。收集到的5份种子样品，每份选取干燥、颗粒饱满的种子至少500 颗，分开摆放，使其没有接触或重叠，使用扫描仪扫描，并通过Winseedle 2019HR 对图片进行分析，得到每粒种子的长度、宽度、长宽比以及投影面积的数据。

②种子千粒重测量方法。从纯净种子中随机取1000 粒，用1/1000 电子天平称重，每组样品不重复取样，称重5次得到种子的千粒重数据。

③种子含水量测量方法。种子含水量的测定参考孙茂[21]的方法，采用高温烘干法。

④种子活力测定方法。参考使用TTC 染色法[22-23]。将种子用30℃水浸泡48 h后，取出种子剥掉种皮用1500 mg/L 的TTC（2,3,5-三苯基氯化四氮唑）溶液30℃进行避光燃染色处理24 h后，取出种子，用清水将种子冲洗2～3 次，观察种胚被染色的程度和染色部位，判断五味子种子生活力强弱。种胚全部或大部分被染成红色的即为具有较强生活力的种子，种胚不被染色的为具有较弱生活力的种子或者死种子。

每组样品每100粒进行不重复5次统计，测算种子活力值[式(1)]。

⑤种子萌发率测定方法。种子萌发率测定参考刘芳[24]的方法，将沙藏后的种子挑选状态良好种子于2021年4月下旬随机取100粒种子置于湿润滤纸上进行后续培养，以种子有胚芽长出为萌发，截至5 月底。每组样品进行不重复5次统计，测算萌发率。

（2）果实数据采集方法。

①表观数据采集方法。对采集到的12 份果实样品每种样品随机取30 串用直尺和游标卡尺测量其果串总长度、果柄长度、果串直径，使用电子天平测量果串总重及果实净重，并统计果实个数。测量完的果实用于多糖和木脂素成分分析。

②多糖数据采集方法。多糖含量测定参考李宝岩[25]的方法。

③木脂素数据采集方法。UPLC色谱柱为ACQUITY UPLC HSS T3 Column(100Å，1.8 μm，2.1 mm×100 mm)；流动相为乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱（洗脱比例0～5 min，50%～55%A；5～8 min，55%～63%A；8～9 min，63%～63%A；9～10 min，63%～80%A；10～12 min，80%～80%A；12～13 min，80%～50%A；13～15 min 50%～50%A）；流速0.3 mL/min；柱温40℃；检测波长220 nm；进样体积10 μL；运行时间15 min。

对照品溶液制备方法。分别精密称取五味子醇甲、五味子醇乙、五味子酯甲、五味子酯乙、五味子甲素、五味子乙素、五味子丙素、戈米辛J、五味子酚对照品适量于10 mL 量瓶中，用甲醇超声溶解并稀释至刻度，配制成含五味子醇甲0.18 mg/mL、五味子醇乙0.28 mg/mL、五味子酯甲0.17 mg/mL、五味子酯乙0.38 mg/mL、五味子甲素0.25 mg/mL、五味子乙素0.17 mg/mL、五味子丙素0.1 mg/mL、戈米辛J0.26mg/mL、五味子酚0.22 mg/mL的混合对照品储备溶液。

供试品溶液制备方法。取南五味子粉末约0.15 g，精密称定，置于25 mL量瓶中，加入甲醇25 mL，称定，超声处理30 min，取出，放冷至室温，加甲醇补足减失的质量，摇匀，用0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得样品检测溶液。每组样品进行6 次重复实验，计算木脂素含量。

（3）环境数据采集方法。环境数据由Watchdog气象定位站和国家气象科学数据中心提供。

1.2.4 数据处理方法 使用Excel、IBM SPSS 软件对数据进行统计分析，使用GraphPad Prism 8.0.2作图。

2 结果与分析

2.1 种子性状

种子投影面积、单粒种子长度以及单粒种子宽度表示了种子的大小，不同生长地的种子大小有较大差异（图1A～C）。单粒种子长/宽则表示了种子形状，不同生长地的种子形状无较大差异（图1D）。种子千粒重是体现种子大小与饱满程度的重要指标，不同产地种子千粒重有较大差异（图1E），Z1与Z3表现最佳，Z2与Z5 表现最差。Z2、Z5 千粒重较低的种子相应的含水率与干重也低（图1F～G），质量也较差。5个样品种子活力值无较大差异（图1H），而种子萌发率有较大差异性（图1I），表现为Z3最佳、Z5最差。

图1 华中五味子种子性状差异

表型变异系数越大，则性状值离散程度越大，表型多样性越大[26]。如表3所示，5个种源地种子相对含水率的变异系数最大为48.70%，其次为种子萌发率为37.98%；种子长宽比变异系数最小为0.93%，表明种子形状并没有随环境变化产生较大变化。

表3 华中五味子种子性状变异系数

如表4 所示，华中五味子种子性状相关性主要表现在种子大小相关的指标即种子投影面积、长度、宽度、长宽比，指标之间表现为显著正相关；种子含水率与种子长宽比显著正相关，其他指标之间不表现显著相关性。

表4 华中五味子种子性状相关性

2.2 果实性状

对所采集到的12个果实样品的果串长度、果串直径、果串质量、果实净重、果实粒数和果柄长度以及华中五味子多糖和木脂素含量共8个参数的组间差异进行分析，分析结果如表5所示。所收集到12个产地的华中五味子各性状均有显著性差异，其中果串长度以及果串质量较其他指标有较明显差异，果实中多糖含量以及五味子酯甲含量有极大的差异性，表明五味子果实性状随生长环境产生较大差异。果实净重/果串质量表示华中五味子果实采收后可用成分的含量，G1（宝鸡市太白县）、G2（商洛市柞水县营盘镇）的果实净重/果串质量较高，其次为G3（汉中市留坝县）、G5（商洛市柞水县杏坪县）以及G6（商洛市镇安县）。G4（商洛市柞水县下梁镇）、G9（安康市石泉县）、G10（安康市汉阴县）、G1（宝鸡市太白县）有较高的多糖含量。

表5 华中五味子果实性状差异

UPLC 所测南五味子木脂素色谱图如图2 所示。《中华人民共和国药典》（2020 版）对于南五味子有效成分规定含五味子酯甲不得少于0.20%，如表5 所示，不同产地华中五味子酯甲含量仅有G4（商洛市柞水县下梁镇）、G5（商洛市柞水县杏坪镇）、G6（商洛市镇安县）、G7（商洛市山阳县）、G8（汉中市略阳县）、G12（云南省维西傈僳自治州）样品符合药典标准，其余6个样品五味子酯甲含量不达标，其中以G4样品的五味子酯甲含量最高，同时如图3所示，G5（商洛市柞水县杏坪镇）、G12（云南省维西傈僳自治州）五味子果实木脂素总含量较少。将五味子酯甲含量与五味子木脂素含量进行相关性分析，两者相关性达到0.973（极显著相关），五味子酯甲在五味子木脂素中占有极大的比例。商洛市柞水县、镇安县、山阳县以及汉中市略阳县所产华中五味子有较高品质。

图2 对照品和南五味子样品UPLC图

图3 华中五味子果实木脂素相对含量

如表6所示，在所测量9种指标中，12个果实来源地果实酯甲含量的变异系数最大为100.33%，其次为果实多糖含量，表明果实内含物含量随环境变化产生明显变化；果实净重/果串质量的变异系数最小为3.41%，其次为果串直径为9.21%，表示华中五味子在生长过程中对果实与果柄的能量分配较为固定，果串的直径较为稳定，受环境影响较小。

表6 华中五味子果实性状变异系数

如表7所示，华中五味子果实性状相关性表现为果实果串直径与果实果串质量呈显著正相关关系；果实净重与果实直径呈显著正相关，与果串质量呈极显著正相关，表示质量越高、直径越高的果串果实更多。每串果实的果实数量与果串直径以及果实净重呈显著正相关，与果串质量呈极显著正相关。果实酯甲含量与果串长度、果串质量以及果实净重呈显著负相关，果实总木脂素含量同样与果串质量和果实质量呈显著负相关。

表7 华中五味子果实性状相关性

2.3 种实性状和环境因子的相关性分析

如表8 所示，种子活力值与海拔呈显著正相关关系，种子萌发率与地位纬度呈显著正相关，与年均降水量呈极显著负相关关系。

表8 华中五味子种子与环境因子的相关性

如表9所示，果实直径与海拔呈极显著正相关关系，与年均温呈显著负相关关系；果实木脂素含量与海拔呈显著正相关关系，与纬度和年均温呈显著负相关关系。

表9 华中五味子果实与环境因子的相关性

3 讨论

不同产地华中五味子种子长宽比无明显差异，是植物对环境长期适应、相对稳定的指标[27]；种子长宽、投影面积所代表的种子大小的表型性状差异明显，在秦岭南北两侧变异丰富；种子千粒重、种子含水率以及种子干重是种子饱满程度的重要指标[28]，随环境均产生较大变异；种子萌发率有较大差异，但与种子大小无相关性，与前人研究结果一致[29]。说明华中五味子种源间存在明显的形态变异，形态变异是遗传变异的重要组成部分，形态变异越大，存在的遗传变异可能越大[30]，华中五味子具有优良种源的选择潜力。

对华中五味子果实进行分析表明，12个产地的华中五味子果实均有较大的变异性，表现为商洛市柞水县与云南傈僳自治县所产果实变异性最大。五味子酯甲含量是果实在12 个产地变异最大的指标，《中华人民共和国药典》（2020 版）[31]规定南五味子有效成分中五味子酯甲不得少于0.20%，本次实验中有6个产地华中五味子果实符合药典标准，其中主要产地为商洛市。五味子酯甲含量与五味子木脂素总量相关性达极显著相关性，表示五味子酯甲是五味子木脂素的主要组成部分，根据与环境因子相关性分析，五味子木脂素含量与地区海拔、纬度和年均温呈显著相关性。

表型多样性是遗传多样性的基础[15]，同一物种在不同居群间发生的变异可以反映出该物种对不同环境的适应能力，物种的变异程度也表明其适应不同生境的广泛程度，通常变异程度较大的物种，其适应的生境也越广[32]。研究表明，华中五味子果实净重/果串质量无较大差异，说明不同生长地的华中五味子果实能量分配较稳定，而果串长度、果串质量、果实净重以及果实粒数有较大差异，尤其表现在宝鸡市（秦岭北坡）所产果实与商洛市、安康市、汉中市（秦岭南坡）所产果实存在差异，表示秦岭南北两侧华中五味子生长有较大差异。

4 结论

根据对华中五味子种子与果实进行分析，秦岭南北两侧华中五味子有较大变异性，主要体现在华中五味子种子的大小、千粒重、含水率、萌发率，以及华中五味子果实果串长度、果串质量、果实质量、多糖含量、五味子酯甲含量。华中五味子性状与环境因子相关性分析表明，种子、果实的性状与一部分环境因子之间呈显著相关性，说明华中五味子随环境产生表型多样性。表型多样性是遗传多样性与环境异质性的综合体现，表型变异中隐藏着遗传变异，对华中五味子遗传特性以及生理生化特性还值得进一步探讨。