种子表型平台的改进及其在芥菜种子活力研究中的应用

陆光远, 游永全, 刘羽婷, 李春生, 韦明肯, 欧阳乐军, Steven Penfield, 赵永国

(1.广东石油化工学院生物与食品工程学院, 广东 茂名 525000; 2.湖北工程学院, 湖北 孝感 432000;3.Department of Crop Genetics,John Innes Centre,Norwich NR4 7UH,UK)

叶用芥菜是我国重要的大宗蔬菜,主要包括大叶芥菜、花叶芥菜、瘤柄芥菜、包心芥菜和分蘖芥菜等多种类型[1],在华南地区常见的芥菜类型包括大叶芥、多裂叶芥、皱叶芥菜、包心芥和水东芥等,其中水东芥菜是以产地赋名的岭南特色名优蔬菜,属于十字花科芸薹属的叶用芥菜(BrassicajunceaL. Coss. var. folosa Bailey,2 n=4 x=36)。水东芥菜历史悠久,主要分布在粤西地区,具有小卷心、茎多叶少、爽脆可口、质嫩无渣、鲜甜味美等特点,深受国内和港澳地区市场欢迎,2007年获得中国国家地理标志产品保护[2]。随着华南地区工业化的完成,农村劳动力成本大幅提高,当前大田蔬菜生产方式正由传统的劳动密集型向规模化、机械化生产发展,通过机械精量播种,可实现一播成苗,避免育苗移栽,从而省工省时,大幅度降低蔬菜生产成本。高活力种子能够显著提高田间出苗率、抵御不良环境条件、增强抗性,是实现精量播种、一播全苗的前提。目前关于芥菜种子活力的研究报道较少。

土壤盐碱化是制约现代农业可持续发展的主要因素之一。我国盐碱地近1亿hm2,广泛分布在内陆和沿海地带,其中华南沿海的盐害类型以氯化钠为主[3]。叶用芥菜作为岭南地区的重要蔬菜,播种和出苗期受到盐碱地的影响严重。因此,开展芥菜耐盐碱性研究,提高种子活力,特别是大田直播条件下芥菜种子萌发和出苗期的耐盐碱性,对于保障我国蔬菜供给安全具有重要意义。

种子萌发是植物生长的第一步,需要在充足的水分、空气和适宜的温度下进行,其过程可分为吸胀、萌动、发芽和成苗四个阶段;种子必须从外界环境吸收足够的水分才能启动一系列酶的活动,开始萌发;当环境水势低于某个临界值时,种子因无法吸收足够水分而停止萌发[4]。近十年来,种子萌发期耐盐性的鉴定已有较多报道,裴毅等[5]分析了白芥种子在不同盐浓度和NaHCO3胁迫下的耐受性;龙卫华等[6]比较了3种油菜萌发期间的耐盐性差异;蹇黎等[7]研究了Na2CO3胁迫对野生油菜种子萌发的影响。在芥菜中,崔世友,张蛟蛟[8]通过滩涂种植和根际土壤电导率测定,鉴定出了强耐盐的野生叶用芥菜材料。王洁等[9]对5个芥菜品种的耐盐性进行综合评价,认为发芽期耐盐性大小依次为甬雪4号、甬雪3号、甬雪1号、科兴雪菜、大丰雪菜。

通过数学建模可以深入研究种子的萌发特性。尽管采用经验的数学模型(比如Hill函数)也可以拟合种子萌发过程,但由于模型中没有引入温度、水分等环境变量,因此无法分析和预测外界因素对种子萌发的影响,也不利于开展遗传机理研究[4]。另外,基于群体阈值的数学模型,比如积水(Hydrotime,HT)、积温(Thermal time,TT)和积温水(Hydrothermol time,HTT)模型,由于这些模型中引入了环境温度T、水势Ψ等变量,因而可以定量分析种子萌发对温度、水分胁迫的响应[10-12]。最近,有研究人员进一步提出了积盐(Halothermal time, HaloTT)模型,用以动态描述盐胁迫下种子萌发速度与盐浓度之间的函数关系[13-14],即:

θHalo=(NaClb(g)-NaCl)tg

(1)

式中,θHalo为常数,NaCl为氯化钠介质浓度,NaClb(g)为种子萌发百分率为g时所能够忍受的最高NaCl浓度,tg为种子萌发百分率达到g所需要的时间。利用上述函数,可以精确预测芥菜种子在盐胁迫下的萌发动力学特性,为研究芥菜高活力种子的遗传机理奠定基础。

本研究在参照前人工作的基础上,改进并构建了新一代的低成本、高通量种子表型平台,可实现无人值守运行,同时利用该平台对芥菜发芽期耐盐性进行了定性和定量分析,旨在为芥菜耐盐品种的选育和栽培提供参考。

1 材料与方法

1.1 植物材料

试验材料为芥菜种子,购自阳春农业生产资料公司,可在华南沿海地区种植。

1.2 种子表型平台构建

参照Colmer等[15]的方法,改进并构建了一个种子表型平台SeedGerm V 2.0(图1 a),主要硬件包括:1个透明的塑料盒(长47 cm×宽34 cm×高29 cm),1个USB接口微型雾化器,1台卡片式微型电脑(树莓派)及其配套的摄像头,按当前市场价其成本不足1 000元,一次可分析小粒种子(芥菜、油菜、辣椒等)300粒或大粒种子(玉米、大豆等)100粒。后期的图像存储和数据分析可在普通的办公电脑进行。发芽箱底部放置一张蓝色的发芽滤纸(可用蓝色吸水棉布代替),蓝色与种皮颜色反差较大,有利于后期的图像数据处理分析。喷雾装置用定时开关控制,以便维持发芽箱的恒定湿度,省去了种子发芽过程中的人工补水程序,可实现全过程无人值守,提高工作效率(图1 b)。

注:a为种子平台总体结构;b为发芽盒俯视图。图1 新一代种子表型平台SeedGerm V 2.0Fig.1 New generation of seed phenotyping platform SeedGerm V 2.0

1.3 种子发芽实验

分别配制5个梯度的NaCl溶液(0,0.075,0.150,0.225 mol/L和0.300 mol/L),模拟不同盐胁迫环境。发芽纸平铺在托盘上,加入相应的NaCl溶液30 mL浸泡20 min,使其充分湿润。挑选健康、饱满、无损伤的芥菜种子,先用3%次氯酸钠消毒10 min,然后蒸馏水反复冲洗干净,之后用镊子将种子均匀地摆放在发芽纸上,每个处理50粒,3次重复。托盘放入种子表型平台,启动程序,开展萌发实验。每天检查发芽情况,并利用微型喷雾器定时补水保湿,发芽试验总天数设置为8 d,人工判读的发芽标准为种子胚根突破种皮1.5 mm。

1.4 发芽图像采集与处理

在种子发芽过程中,首先利用树莓派控制的摄像头自动定期(比如1张/h)抓拍图片,实验结束后将所有图片通过网络输入计算机。当图像采集程序开始运行后,尽量不再移动发芽箱的位置,否则可能影响拍摄质量,不利于后期对结果进行分析。人工删除曝光不足(晚上拍摄)的图片,同时对图像进行适当的裁剪和对比度调整,最后将系列图像导入软件SeedGerm(https://github.com/Crop-Phenomics-Group/SeedGerm/releases)中运行,可自动获得发芽率、平均发芽时间等数据。

1.5 种子萌发参数估算

将种子表型平台输出的种子发芽数据导入MS Excel 2019软件,利用Hill函数进一步进行曲线拟合,计算获得T50(发芽率达到最大值一半所需的时间)、U2575(发芽率达到75%与25%所需时间之差)、AUC(发芽曲线面积)、MGT(平均萌发时间)等种子萌发动力学参数,可以比较种子在不同盐胁迫环境下的种子活力、整齐度、一致性的变化情况,从而评价种子萌发期的耐盐性。

1.6 积盐模型的构建与预测

由于Hill函数没有引入盐浓度等关键参数,因而无法对不同盐胁迫下的种子萌发情况进行分析和预测。为此,进一步利用HaloTT模型分析发芽数据。通过公式(1)变换后得到公式(2),其生物学含义更加直观,即种子萌发速度GR与盐浓度NaCl呈线性关系,其斜率的倒数即为θHalo:

GR=1/tg=[NaClb(g)- NaCl]/θHalo

(2)

其中:θHalo为积盐常数;NaCl为种子开始萌发的NaCl介质浓度;NaClb(g)为基础盐浓度,即种子萌发时能够忍受的最高NaCl浓度,该值与发芽百分比g有关,近似服从正态分布;tg为达到种子萌发百分率g所需要的时间;1/tg为萌发速率GR。利用Origin 2018软件进行线性回归分析,可估算参数θHalo和NaClb(g)。由于种子萌发曲线近似于正态分布,因此通过probit转换可将曲线转化为直线,以便估算参数:

Probit(g)=[NaCl+θHalo/tg-NaClb(50)]/δNaClb

(3)

在上述公式中,NaClb(g)服从正态分布,其平均值为NaClb(50)(即种子萌发率为50%时所能忍受的最高NaCl浓度),标准方差为δNaClb[14]。

2 结果与分析

2.1 种子发芽动态检测

利用改进后的种子表型平台SeedGerm V 2.0,在5种不同NaCl浓度胁迫下分别进行芥菜种子萌发实验(图2 a)。每次发芽实验设置3个重复(50粒/重复),种子放置在发芽纸(布)上,成像间隔为1 h,共采集了192张图像,历时8 d。可以看出,种子发芽120 h后,在低浓度的NaCl中,几乎所有种子都能够发芽,而且胚芽较长;而在中等和高浓度盐胁迫下,发芽率明显下降,甚至不能萌发(图2 a)。种子平台软件通过对大量图片的处理和分析(图2 b),可直接输出累积萌发曲线,T30、T50、T70发芽时间(可用来评价萌发的整齐度),以及Gmax(试验结束时种子的最终发芽率)(图2 c)。此外,软件还自动生成了须盒图(示例中展示了T50的统计离散性),以方便评估发芽的均匀性或变异性。最后,软件还提供了不同时间点所有种子萌发数据的Excel文件,以便对所有数据进行整合后进一步统计分析。

2.2 种子表型平台的可靠性

为了验证种子表型平台及图像分析软件Seed Germ的可靠性,对芥菜种子在正常条件下的发芽图像进行软件识别和人工统计,并比较两者的异同。结果表明,SeedGerm软件生产的种子萌发数据与人工统计结果整体上的发芽率增长趋势基本一致,但是软件生产的种子萌发数据折线图整体略为滞后于人工统计的种子萌发结果(图3),这可能是由于判定种子萌发的标准差异造成的。软件将种子的体积增长超过10%判定为发芽,而人工的判断标准是胚根长度达到1.5 mm或种子直径的一半。进一步计算了软件生成和人工判读发芽数据的相关性,结果发现其相关系数为 0.988,达到极显著水平(p<0.001),表明种子平台具有较高的可靠性和准确性,适合开展芥菜种子活力研究。

图3 SeedGerm生产和人工统计的芥菜种子发芽率比较Fig.3 Comparison of mustard seed germination rate obtained by SeedGerm and artificial counting

2.3 芥菜种子对盐胁迫的响应

由图4可知,对照的发芽情况较好,发芽44 h后发芽率即达到100%。在极低盐浓度(0.075 mol/L)条件下,种子的萌发不但没有受到抑制,反而具有一定的促进作用,实验开始12 h后发芽率为28%,高于对照的20%,表明适量的NaCl是维持植物生长发育所必需的,其最终发芽率与对照相近。随着盐浓度的升高,种子发芽开始受到明显影响,在0.150 mol/L条件下,种子的最终发芽率降低到80%,同时达到最终发芽率所需时间延长到60 h左右;在中度(0.225 mol/L)盐胁迫下,种子的发芽率仅有40%,达到最终发芽率的时间继续推迟到80 h左右;而在重度(0.300 mol/L)盐胁迫下种子基本丧失了发芽能力,同时达到最终发芽率所需时间>100 h(图4)。由此可见,极低浓度的盐能够促进发芽,但随着浓度的升高,种子的发芽受到抑制,且可以明显看出种子萌发率、萌发速度均与NaCl浓度成反比。

注:发芽率为均值±标准差(n=3)。图4 不同NaCl浓度下芥菜种子萌发曲线Fig.4 Germination curve of mustard seeds under different NaCl concentrations

2.4 芥菜种子的萌发动力学分析

利用Hill函数对芥菜种子在不同盐浓度下的种子萌发曲线进行拟合,并求算出最终发芽率、T50、Gmax(h)、U7525(h)、AUC、MGT等特征参数(表1),以便比较不同基因型芥菜的耐盐性差异。

表1 不同NaCl胁迫下的种子萌发参数Table 1 Germination parameters of mustard seeds under different NaCl stresses

T50为达到最高萌发率一半所需的时间,时间越短,表明种子活力越高。在NaCl浓度为0 mol/L的条件下芥菜种子的T50值较小(14.2 h),表明供试品种的种子活力很强,14 h左右即有一半种子萌发;随着盐浓度的升高,总体上T50值也逐渐变大,但在0.075的极低浓度条件下,T50值不升反降,仅为12.5 h,再次说明极低浓度的盐溶液能够促进种子萌发,加快发芽速度。当盐浓度为0.15～0.225 mol/L时,T50显著增大到30 h左右,而在NaCl浓度为0.300 mol/L的条件下芥菜种子的T50值最大,为56.8 h,表明种子发芽严重受阻。

U7525是指达到发芽率75%与25%所需时间的差值,该值越小,表明种子的萌发一致性和整齐度越好。可以看出,在水或低盐浓度下,芥菜种子的U7525在3.0～10.6 h之间,数据较小,说明发芽的一致性较高,而NaCl浓度为0.225 mol/L时,U7525急剧上升到23.8 h,说明高浓度盐溶液延缓了发芽,并且发芽整齐度较差;当盐浓度上升为0.300 mol/L时,U7525值又降低至5.6 h,这是由于高盐胁迫下种子总体的发芽率较低、变异较小造成的。

AUC是指种子萌发曲线下的面积,能更加全面、综合地反映种子萌发的质量,AUC值越大,表示种子萌发的速度越快、质量越好。在对照和极低盐浓度条件下,芥菜种子的AUC值在179%/h以上,表明种子活力最强,在中等盐浓度条件下(0.15 mol/L),AUC值降低到135.5%/h;在高盐条件下(0.225～0.300 mol/L)AUC值仅有67%/h以下,表明其种子活力较差。由此可见,AUC值十分灵敏,适合于作为逆境胁迫下种子活力鉴定的重要指标。

MGT是指所有种子完成萌发所需时间的平均值,MGT值越小,说明种子萌发的速度越快,种子活力越高。MGT的变化趋势与T50相似,即盐浓度越高,种子平均萌发时间就越长,该种环境条件下种子的活力就越低(表1)。

2.5 盐胁迫下种子萌发的积盐模型及预测

芥菜种子的萌发曲线为“S”型曲线,近似服从正态分布的累积函数,通过Probit转换可以转化为直线,方便模型拟合和参数估算。在本研究中,利用公式(3)对不同盐浓度下的芥菜种子的种子萌发数据进行了拟合,构建了以盐浓度(X)为自变量、种子发芽率(Y, probit转换)为因变量的预测模型(公式):

Y=-14.993X+3.289

(4)

上述预测模型的决定系数R2为0.923,达极显著水平(p=0.008),说明曲线拟合效果良好(图5)。拟合后得到积盐常数θhalo为2.26 mol/(L·h);根据上述线性方程的斜率和截距,可以进一步求得NaClb(50)为0.22 mol/L,其标准方差δNaClb为0.067 mol/L。利用这些参数,得到盐胁迫下发芽率的预测方程为:

图5 Halothermal time模型回归分析芥菜种子的萌发Fig.5 Regression analysis of Halothermal time model for mustard seed germination

Probit(g)=(NaCl+2.26/tg-0.22)/0.067

(5)

利用公式(5)可以预测在一定范围内不同盐浓度下芥菜种子的种子发芽率。比如,利用预测模型计算芥菜种子在上述5个NaCl浓度梯度下的预测发芽率,结果发现,预测结果与实验数据较为吻合,决定系数R2在0.867～0.963之间,说明预测效果良好。

3 讨论与结论

种子不仅是重要的食物来源,也是最重要的农业生产资料。种子质量对作物产量具有决定性作用[16],因此开展种子活力研究十分必要。长期以来,种子发芽实验基本靠人工进行,不仅工作量大,劳动强度高,而且效率低、周期长,还容易受到实验人员主观因素的影响,因而限制了种子科学研究的规模和准确性[17]。 近十年来,随着植物表型组学的快速发展,一些适用于种子萌发和幼苗活力研究的表型平台已经涌现,比如Germinator、MultiSense、PhenoSeeder、SeedAIXPERT 和 SAGA等[18-22],这些技术平台虽然技术先进,但由于成本高昂、技术复杂、通量低,普通实验室难以获得,因而其应用仅仅局限在少数的国家研究中心或跨国种业公司手中。为此,Colmer等[15]开发了低成本、高通量、易拓展的SeedGerm种子表型平台,十分适合普通实验室和种子公司使用。但该平台在使用过程中,需要频繁打开带有摄像头的发芽箱盖子进行人工补充水分,操作十分繁琐,很容易使摄像头位置变动,造成拍摄的图像位移,给后续的图像处理带来困难。为此,在发芽盒内部添加了微型喷雾装置(图1),可定期自动加水,无须人工干预,从而实现了无人值守运行,工作效率进一步提高,效果良好。利用该平台分析了芥菜种子在不同盐胁迫下的种子发芽情况,发现机器判读的发芽数据与人工统计结果十分接近,相关性达到极显著水平,充分说明该发芽平台的可靠性(图2)。尽管如此,该平台仍然存在一些不足,比如树莓派的摄像头较小,分辨率和景深有限,如果种子过小(拟南芥种子),则难以获得足够清晰的图像;在补水过程中,喷雾器喷洒出来的水分同样会使树莓派的镜头模糊不清,影响拍摄图像质量。

种子在大田条件下很容易受到温度、水分、盐碱等环境因素的影响[23],而且随着全球气候变暖,未来干旱、炎热和盐碱化将进一步加剧,因此需要有一个种子萌发预测模型,以便在生产前进行规划和决策[24]。油菜种子发芽率会随着盐度的增加而下降,浓度达到250 mmol/L时完全停止发芽[25],这种发芽率降低通常与较低的渗透势和离子毒性有关[26]。以往研究表明,盐胁迫通过改变酶活性、破坏细胞膜和细胞器,破坏参与发芽的生物分子的结构和功能来影响种子活力[27]。种子吸收盐离子的能力取决于细胞膜的通透性,通过调节其内部渗透势,可以增加胚胎膨压,使种子可在较低的水势下萌发[14]。

HaloTT模型可以表征一个种子群体在萌发过程中的平均表现(即NaClb(50))以及个体之间的变异(即σNaClb);NaClb(50)下降的原因可能是细胞膜完整性丧失,其证据之一是种子浸出液的电导率值增加[23]。而且具有更大NaClb(50)和σNaClb的种子群体可以在更多和更复杂的逆境胁迫环境下萌发[28]。因此,种子群体阈值NaClb(50)可作为有效预测发芽时间或决定种子活力的指标[29]。通过记录种子在一系列环境条件下的发芽时间,并计算种子萌发模型阈值等参数,可以预测该种子群体的发芽率和时间[30]。Liu等[23]以13个一年生沙漠物种为研究材料,在实验室采集发芽数据,构建HaloTT模型,可准确描述和预测该物种在相同栖息地的发芽时机和发芽率。本研究初步构建了HaloTT模型,可以准确预测芥菜种子在实验模拟盐胁迫条件下的种子发芽率(图6),但能否预测大田的发芽情况还需要开展更多的野外实验。

注:线为模型预测值,点为实验测定值。图6 利用Halothermal time模型预测芥菜种子在不同NaCl浓度胁迫下的萌发情况Fig.6 Prediction of germination under different NaCl concentration for mustard seeds using Halothermal time model

综上,本研究利用种子表型平台,能够准确记载种子萌发的动态过程并自动生成发芽数据,在此基础上进一步利用基于群体阈值的数学模型,对盐胁迫下芥菜种子的萌发动力学进行定量分析,构建了一个可准确预测一定范围内不同盐胁迫条件下的芥菜种子发芽率,从而为芥菜大田生产提供决策依据。