水稻萌发耐淹性鉴定评价方法研究及种质资源筛选

孙志广 刘艳 李景芳 周振玲 邢运高 徐波周群 王德荣 卢百关 方兆伟 王宝祥 徐大勇

（连云港市农业科学院/江苏省现代作物生产协同创新中心，江苏连云港222006；第一作者：zhiguangsun@126.com；*通讯作者：wbxrice@163.com；xudayong3030@sina.com）

随着适宜直播水稻品种的成功培育和直播稻栽培技术水平的提高，加上种子萌发过程中提高对低氧的耐性有助于杂草的控制，资源和劳动力节约型的直播稻越来越受到种植户的青睐[1-3]。土地的不平整和排水后的强降雨往往会导致直播稻播种后发生淹涝[4-5]。研究表明，土壤中O2含量超过3%才能满足水稻对氧的正常吸收，O2含量超过5%水稻才能正常生长，而淹水6～10 h，稻田土壤中O2含量降至接近于0[6-7]。因此，淹涝会严重影响水稻种子的正常萌发，大幅降低直播稻的出苗率，进而造成稻田缺棵断垄、苗稀苗弱，给直播稻的稳产高产带来严重威胁[8]。强萌发耐淹性种质在低氧环境胁迫下胚芽鞘能够迅速伸长，这种淹水诱导的胚芽鞘伸长是帮助淹水植物重新与空气接触的重要逃逸机制[9]。因此，提高萌发期水稻品种的耐淹性有助于改善水稻的出苗整齐度及出苗率。

如何快速准确筛选耐低氧萌发水稻种质资源是培育萌发耐淹性水稻新品种和开展其遗传机理研究的前提。建立简便、高效而准确的萌发耐淹性鉴定方法，明确水稻种质萌发耐淹性评价标准是筛选萌发耐淹性水稻种质的重要环节。国内外学者多采用水层隔绝空气营造低氧环境，以淹水后的胚芽鞘长度为指标进行萌发耐淹性鉴定，该方法操作简便、对设备要求不高，适合大规模种质资源的筛选鉴定[10-12]。SUN 等[13]以30 ℃、10 cm 水深、萌发4 d 的胚芽鞘长为指标进行萌发耐淹性鉴定，在粳型杂草稻中克隆了决定低氧下强萌发的关键基因OsGF14h。王洋等[14]以30 ℃、5 cm 水深、萌发7 d 的胚芽鞘长为指标进行耐低氧萌发测定，在2 个水稻定位群体中检测到8 个耐缺氧能力的QTL。JIANG等[15-16]以水温30 ℃、水深20 cm、萌发5 d 后的胚芽鞘长为指标评价了359 份水稻种质的低氧发芽能力，表明水稻种质间存在着明显的地域和籼粳差异。陈孙禄等[17]在28 ℃、密闭的离心管中以萌发7 d 后的胚芽鞘长为指标评价了256 份水稻种质的萌发耐淹性，发现籼粳稻间的萌发耐淹性差异并不显著。孙志广等[18]以26 ℃、5 cm 水深、萌发7 d 的胚芽鞘长为指标完成191份种质资源萌发耐淹性鉴定，筛选获得12 份强萌发耐淹性种质，并发现种质资源间的萌发耐淹能力没有明显的地域性差异。由此可见，以往评价不同水稻种质萌发耐淹能力时，由于缺乏统一的萌发耐淹性评价体系，在淹水天数、淹水温度、淹水深度等方面存在较大差异，导致各研究者之间的鉴定结果难以比较，不利于水稻萌发耐淹性研究工作的开展。因此，确立萌发耐淹性鉴定的适宜淹水深度、调查时间和环境温度十分必要。

本研究利用20 份水稻种质资源分析低氧环境不同梯度处理下（温度、调查时间、淹水深度）水稻胚芽鞘的长度，明确了水稻萌发耐淹性鉴定适宜的淹水深度、温度和最佳调查时间，建立了一种简便高效的水稻萌发耐淹性鉴定评价方法，并利用该方法进行水稻萌发耐淹性种质资源筛选，为水稻萌发耐淹性优异种质资源的发掘和创新利用提供有效方法和材料支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试材料共计160 份，其中20 份种质用于水稻萌发耐淹性鉴定方法的建立，分别来自我国江苏、浙江、天津、广东、安徽、江西以及印度的具有不同萌发耐淹能力的水稻品种（表1）。其余140 份材料用于种质资源筛选。这些水稻种质资源于2020年5 月15 日播种于连云港市农业科学院东辛农场试验基地（东经119°32′，北纬34°56′），10 月15 日同时收获，为减少种子休眠带来的影响，所有供试材料均在50 ℃条件下处理1周以打破种子休眠。本实验于2021年7—9 月在连云港市农业科学院中心实验室进行。

表1 参试品种名称及来源

1.2 试验方法

1.2.1 水稻萌发耐淹性鉴定方法确立

每品种挑选饱满均一的干种子36 粒，分3 次重复，在1.5%（v/v）次氯酸钠溶液中处理12 min，并用纯水冲洗8 次，将种子置于20 cm 深的透明塑料杯中，随后将纯水小心的倒入杯中，确保种子沉入杯底。共设3个温度梯度（20 ℃、25 ℃和30 ℃）、7 个时间梯度（3 d、5 d、7 d、9 d、11 d、13 d 和15 d）和6 个水深梯度（3 cm、6 cm、9 cm、12 cm、15 cm 和18 cm），将这些杯子根据不同处理置于不同参数的人工气候培养箱（海博RX-500DH）中，每天傍晚检查水位线刻度并补充相应水分，每3 d 更换1 次纯水。按照预定处理天数测量胚芽鞘长，精确到1 mm，随机区组排列，剔除双极值后，取3 次胚芽鞘长度的平均值作为表型值进行比较分析。

1.2.2 种质资源筛选

参照本研究确立的方法进行水稻萌发耐淹性种质资源筛选，温度设置为30 ℃，淹水深度为20 cm（容器深度为20 cm，方便注水），在淹水后第11 d 测量胚芽鞘长度，其余步骤同上。

1.3 统计分析

利用Microsoft Excel 2010 软件进行数据录入，利用GraphPad Prism 8.3.0 软件进行折线图、箱线图、频率分布直方图绘制和不同处理条件下参试种质胚芽鞘长的描述性统计分析，利用万深SC-E 种子大米外观品质检测分析仪系统进行参试种质资源稻谷籽粒性状分析，利用Origin 2021 软件，根据Pearson’s 相关系数检验籽粒性状与萌发耐淹性的相关性。

2 结果与分析

2.1 描述性统计分析

本研究发现，在各处理间粳稻的平均胚芽鞘长度均高于籼稻，除淹水6 cm 时粳稻的胚芽鞘长最小值低于籼稻外，其余各处理粳稻的胚芽鞘长最小值均大于籼稻；在16 个处理中，粳稻胚芽鞘长最大值低于籼稻的处理有5 个（淹水天数3 d、13 d、淹水深度6 cm、温度20 ℃、25 ℃）；在各处理中，籼稻品种的标准差和变异系数均高于粳稻，说明籼稻品种的个体之间差异大，离散程度高（表2）。

表2 不同处理下胚芽鞘长描述性统计分析

2.2 低氧胁迫对水稻胚芽鞘长度的影响

在30 ℃条件下，淹水深度为3 cm 时参试粳稻的平均胚芽鞘长为50.8 mm，淹水深度≥6 cm 时参试粳稻的胚芽鞘长显著降低，平均为43.5 mm，各处理之间差异不显著；当淹水深度为3 cm 和6 cm 时，参试籼稻的平均胚芽鞘长分别为45.5 mm 和40.1 mm，淹水深度≥9 cm 时参试籼稻的胚芽鞘长显著降低，平均为35.4 mm，各处理间差异不显著（图1A）。在淹水深度20 cm 条件下，温度分别为20 ℃和25 ℃时，粳稻种质的平均胚芽鞘长分别为29.1 mm 和28.4 mm，两者间差异不显著；当温度升高至30 ℃，粳稻种质的平均胚芽鞘长升高到42.5 mm，与20 ℃和25 ℃温度处理存在极显著差异；温度为20 ℃、25 ℃和30 ℃时，参试籼稻的平均胚芽鞘长分别为23.7 mm、24.4 mm 和36.5 mm，变化趋势与粳稻一致（图1B）。调查时期梯度处理结果表明，随着处理时间的延长，所有参试材料的胚芽鞘长度均呈不断增加的趋势（图1C）。

图1 不同低氧条件下籼粳稻胚芽鞘长的比较

2.3 水稻萌发耐淹性最适温度、淹水深度、调查时期确定

从图1A 可见，当淹水深度≥6 cm 时，参试粳稻种质的平均胚芽鞘长不再降低，维持在一个比较稳定的水平，因此，认为粳稻种质萌发耐淹性鉴定的临界水深为6 cm；同理，参试籼稻种质萌发耐淹性鉴定的临界水深为9 cm。由图2A 可见，无论是籼稻还是粳稻，其胚芽鞘长的四分位差均在30 ℃处理时达到最大，因此，推测在30 ℃下进行萌发耐淹性鉴定能够较好将不同水稻品种的低氧发芽能力予以区分。从图2B 可见，随着调查时间的增加，参试种质胚芽鞘长的四分位差呈先增加后降低的趋势，籼粳稻均在第11 d 达到峰值，因此认为淹水处理11 d 是水稻萌发耐淹性鉴定调查的最佳时期。

图2 不同低氧胁迫下籼粳稻胚芽鞘长的四分位差

2.4 籽粒性状与萌发耐淹性的相关性分析

为了解析水稻籽粒性状对萌发耐淹性的影响，本研究对参试种质的籽粒性状与低氧下的胚芽鞘长进行相关性分析。结果表明，参试种质的萌发耐淹性与千粒重、粒宽呈显著正相关，相关系数分别为0.69、0.68；与籽粒长宽比、粒长呈显著负相关，相关系数分别为-0.65、-0.46（图3A）；将籼粳亚种单独分析，发现粳稻的萌发耐淹性仅与千粒重呈显著正相关，相关系数为0.65，而籼稻的萌发耐淹性与籽粒性状不相关（图3B 和图3C）。

图3 籽粒性状与萌发耐淹性的相关性分析

2.5 萌发耐淹性种质资源筛选

利用上述确立的鉴定方法，对140 份地方种质资源进行萌发耐淹性鉴定，结果表明，参试种质在低氧条件下的胚芽鞘长呈连续性分布，变化范围为13.6～56.8 mm，平均值为41.8 mm，变异系数为19.0%，说明这些品种的低氧萌发能力具有广泛的遗传多样性（图4）；其中处于40～45 mm 范围内的品种最多，达到35份，占比25.0%，其次是45～50 mm 和35～40 mm 范围，分别为29 个和23 个，三者合计占总数的62.1%。参试品种中达到强萌发耐淹性的品种有6 份（胚芽鞘长≥55 mm），分别为二郎早、九月黄、穞稻、山紫糯、红壳糯和兴国，可作为亲本资源进行强萌发耐淹性水稻新品种的培育。

图4 140 份种质资源萌发耐淹性频率分布直方图

3 讨论与结论

在淹水胁迫下，“拿住苗”是直播水稻生产的关键问题，因此，选用低氧发芽能力强的水稻品种对直播水稻的安全生产十分重要。相对于其他谷类作物，水稻具有较强的低氧发芽能力，但是品种间仍存在较大差异，如何高效、准确评价水稻种质的萌发耐淹性成为培育适宜直播水稻新品种和开展水稻低氧萌发遗传机理研究的限制性因素[19]。利用水层隔绝空气营造低氧环境，以淹水后的胚芽鞘长度作为指标被认为是水稻萌发耐淹性鉴定简便、可靠的方法，为大规模种质资源筛选、定位群体的表型鉴定奠定了重要的方法基础。

本研究利用梯度试验的方法，运用四分位差法分析，确定了水稻萌发耐淹性鉴定的临界淹水深度、最适温度和最佳调查时期，为水稻萌发耐淹性研究提供了有据可依的鉴定方法。利用本研究确立的方法，穞稻、南粳46 的胚芽鞘长分别为56.3 mm 和49.5 mm，表现出较强的萌发耐淹性，与前人研究结果一致[20-21]。ANGAJI 等[22]利用强萌发耐淹性水稻品种Khao Hlan On的BC2F2群体定位到5 个萌发耐淹性QTL，在该研究中，来自国际水稻研究所的2 个籼稻品种IR42 和IR64被列为感性对照；在本研究种质资源筛选中，R42、IR64的胚芽鞘长分别为28.6 mm 和32.0 mm，表现为低氧敏感，这与ANGAJI 等的研究结果一致。侯名语等[16]利用耐水淹品种Kinmaze 的重组自交系进行萌发耐淹性QTL 定位，在水稻第1、2、5 和7 染色体上共检测到5个QTL，低氧敏感籼稻品种DV85 淹水5 d 后的胚芽鞘长仅为3 mm，表现为极感。利用本研究确立的方法，DV85 淹水11 d 后的胚芽鞘长为13.6 mm，在所有参试种质中最短，同样表现为极感。以上这些结果证明了本研究确立的萌发耐淹性鉴定方法是可靠的。

由于淹水后的氧气含量急剧下降，碳水化合物的分解代谢从有氧途径转变为厌氧途径，这一过程中，ATP的产生效率比有氧呼吸低18 倍，因此强萌发耐淹性水稻种质需要更多的能量储存来满足胚芽鞘的伸长[23-25]。由此我们推测籽粒性状可能与水稻种质的萌发耐淹能力存在一定关联，因此，本研究对供试材料的籽粒性状与萌发耐淹性进行了相关性分析，探讨萌发耐淹性与籽粒性状的关系，以期为强萌发耐淹性水稻新品种选育提供参考。经过相关性分析发现，粳稻淹水后的胚芽鞘长度与籽粒的千粒重呈显著的正相关（相关系数为0.65），而籼稻的籽粒性状与萌发耐淹性不相关，因此育种家在选育适宜轻简栽培的粳稻新品种过程中，应注意加强对大粒重单株的选择。