稻田除草剂应用现状与抗除草剂水稻育种研究进展

胡江博 任正鹏， 丁翔， 王朝全 冯阳， 王笑见 张翔 胥南飞，*

（1 四川天豫兴禾生物科技有限公司，成都610031；2 合肥丰乐种业股份有限公司，合肥231283；第一作者：jbhu@gevoto；*通讯作者:nfxu@gevoto.com）

水稻是我国三大主粮之一，年平均种植面积约3 000 万hm2，总产量约21 000 万t，水稻稳产对我国粮食供应和社会稳定发挥着至关重要的作用[1]。由于杂草与水稻共生时间长，严重影响水稻生长，我国每年因杂草危害直接导致的稻谷损失约占15%～20%，杂草防控已成为水稻种植中的主要劳作之一。近年来，随着轻简化栽培技术快速发展，迫切需要更加有效的杂草防控措施[2]。除草剂是目前最有效、最经济的除草手段，能有效防控杂草和提高水稻产量。在我国水稻生产中，需在多个时期喷施除草剂，共需10 余种除草剂叠加使用，药剂种类多、除草成本高，且不同除草剂对施用条件都有严格限制，已无法满足水稻轻简高效绿色种植的需求。

现阶段，能有效解决稻田杂草的办法主要有2 种：持续开发具有新作用机制的除草剂轮换使用和创制抗除草剂水稻新品种。但随着开发新型除草剂越来越困难，培育具有自主知识产权的抗除草剂水稻新种质，从而扩大其配套除草剂的应用范围就显得尤为重要。随着我国水稻耕作方式的改变，迫切需要深入挖掘水稻自身除草剂抗性新基因、探寻除草剂生物育种新途径、培育抗除草剂水稻新种质[3]。

1 稻田常见杂草及其发生规律

据统计，我国稻田杂草有200 多种，比较常见、危害较重的约40 种。我国水稻种植过程中，除草剂开支的80%以上用于防除稗草和千金子[4]。其中，稗草是水稻田排名第一的恶性杂草，危害面积约占播种面积的40%。另外，杂草稻是直播稻田除稗草、千金子外第三大抗性杂草，具有生长速度快、繁殖能力强、常规除草技术难以防除等特点，导致其快速泛滥[5]。近年来，杂草问题已成为抑制水稻正常生长、影响农户种植积极性的重要因素[6]。

稻田杂草的萌发高峰期大致分为3 个阶段，播种或移栽后7～10 d 出现第1 个出草高峰，约占杂草发生总量的45%～70%[7]；播种或移栽后20 d 为第2 次萌发高峰，以莎草科和阔叶杂草为主；第3 次出草峰值出现在播种或移栽后20～30 d，一般以阔叶杂草为主。

2 不同水稻种植模式杂草控制措施

随着农村劳动力年龄结构发生变化，现在种田的多为中老年人，已难以承受育秧、移栽等繁重的田间劳作；同时，随着人力成本不断上升，迫使种植户越来越多选择直播稻等轻简化种植模式。但杂草问题极大限制了直播技术的大规模推广和应用，迫切需要更有效的杂草防控措施。不同水稻种植模式下的杂草发生规律和相应除草策略不同[8]。

2.1 直播稻田杂草控制措施

直播是水稻生产实现规模化、机械化、集约化的重要技术。但直播田杂草先于水稻萌发，二者共生时间长，除草难度大，极大限制了直播稻发展[9]。直播田一般使用“一封、二杀、三补”的杂草防控策略，“一封”是在播后、苗前选用2～3 种除草谱广的除草剂进行土壤封闭杀草；“二杀”是在水稻3 叶期，选用多种苗后选择性除草剂进行除草；“三补”是在播后30 d 对抗性杂草进行针对性补防[10]。

2.2 移栽田杂草控制措施

移栽田秧苗较大，稻根入土较深，抗药性较强；同时，气温适宜、杂草发生种类多。移栽田多采用“狠抓前期，挑治中、后期”的除草策略，移栽前先用2～3 种除草剂进行封闭，施药后2～5 d 插秧；移栽后5～10 d，用多种除草剂对大部分杂草进行防除，用药后需保水1 周；在分蘖期按实际情况用选择性除草剂补防1～2 次[11]。

3 稻田常用除草剂及应用现状

3.1 选择性除草剂应用现状及待解决问题

本节选择了在水稻种植中使用量大且除草效果较好的几种选择性除草剂[12]和常用的灭生性除草剂，分析、比较了不同除草剂在水稻田中的除草优势和不足（表1）。

表1 水稻田常用除草剂优缺点分析

由于除草剂长期不合理使用，近年来杂草群落演替加快、抗性杂草蔓延迅速、杂草数量呈直线上升趋势。2021年全国农业有害生物抗药性监测报告显示，稗草和千金子对氰氟草酯的抗性频率分别超过65.4%和78.3%；稗草对五氟磺草胺抗性频率已超过76.8%，且五氟磺草胺对千金子无效[13]；在我国某些地区稗草对丁草胺的抗性已超过70.0%[14]；稗草对二氯喹啉酸抗性频率已超过91.5%[15]。

截止2019年，全球已有255 种杂草的496 个杂草生物型对除草剂产生抗性，其中对ALS 抑制剂产生抗性的达到160 个杂草生物型，约占总数的1/3[16]，详细数据可参考图1[17]。另外，光系统Ⅱ抑制剂和ACCase 类抑制剂由于抗性位点单一，抗性杂草的发展速度非常迅猛（C2、C2、C5 和A 组）。草甘膦抗性杂草近几年在全球发展较快（G 组），但由于过去20 多年草甘膦在转基因抗草甘膦作物上使用量巨大，同时考虑到抗性衰减及可能存在的抗性漂移等因素，整体而言其抗性杂草发展相对较慢，抗性发展趋势处于稳定范围。草铵膦和三酮类除草剂（F2 组）抗性杂草的发展速度相对缓慢，抗性风险较低[17]。

图1 不同作用机理除草剂抗性杂草的发展趋势图[17]

另外，除草剂的残留问题一直未得到人们足够的重视，除草剂使用不当容易在土壤和水体中残留，不仅影响当季作物，还会严重影响后茬作物。冯莉等[18]研究了5 种稻田常用除草剂对后茬马铃薯的影响，发现噁唑酰草胺、双草醚、五氟磺草胺、苄嘧磺隆、二氯喹啉酸对马铃薯的抑制程度依次由低到高，双草醚在推荐剂量可对马铃薯产生药害，二氯喹啉酸在推荐剂量的1/15～1/20 即对马铃薯地上生长抑制率达50%。王子臣[19]等试验了3 种稻田常用除草剂在水体残留对大藻生长的影响，其中苄嘧磺隆可导致大藻大量死亡，2 甲4 氯钠和丁草胺亦均会对大藻生长产生一定抑制作用。王新等[20]研究了咪唑啉酮类除草剂残留对后茬作物影响，发现咪唑乙烟酸虽然使用当年可降解96%，但剩余部分会在土壤中长期残留，对后茬作物造成药害，其低剂量即可抑制后茬油菜株高，较高剂量残留会导致油菜全部死亡。

其次，在环境中残留期长的除草剂对动物、生活用水等有多大影响？虽然目前很少有这方面的研究报道，但这是我们不应该忽视的问题。

3.2 广谱型除草剂应用范围及除草优势

草铵膦和草甘膦属于广谱型除草剂，与咪唑啉酮类除草剂相比，具有残留期短、不易产生抗药性、对环境友好、价格低廉等优点。有数据显示，草甘膦、草铵膦和硝磺草酮在全球除草剂销量排行榜位居前三[21]。由此可见，除草剂正朝着高效、低毒、无残留、杀草谱广和环境友好型的方向发展。

3.2.1 草甘膦

内吸型灭生性除草剂，通过抑制植物体烯醇丙酮基莽草素磷酸合成酶EPSPS，影响莽草酸向芳香族氨基酸的转化，导致其蛋白质合成受阻。草甘膦可防除40 余科、130 多种植物，在植物体内和分蘖间皆可传导，并由地上组织传导至根部。草甘膦使用后7 d 见效，无残留，不影响后茬作物和土壤结构，对地下水无污染，对环境友好，用药后7～10 d 即可播种、移栽[22]。独特的除草机制、优异的除草效果、安全性高及能在转基因抗草甘膦作物上使用，促使其成为全球用量最大的除草剂[23]。

3.2.2 草铵膦

触杀型灭生性除草剂，通过抑制植物氮代谢途径中谷氨酰胺合成酶GS，干扰植物正常代谢致死。草铵膦能快速杀死绝大多数杂草。草铵膦喷施后3 d 即可杀死杂草，使用4 d 后即可播种移栽，对土壤、作物根系和后茬无影响，持效期较长，在土壤中易降解，对作物安全，不易飘移。生产中应用草铵膦具有除草活性高、广谱、低毒、对环境友好等优点。

3.2.3 三酮类除草剂

通过抑制对羟基苯丙酮酸双加氧酶HPPD，影响类胡萝卜素合成，促使杂草的分生组织和新生器官出现白化症状而死；能高效防除阔叶杂草及部分禾本科杂草，具有良好的触杀和内吸作用。三酮类除草剂药后3～7 d 见效，持效期较长，但不会影响后茬作物，药后3 h 遇雨药效不受影响。该类除草剂目前仅有4 例抗性杂草报道，非常适合抗性杂草的综合治理[24]。

草甘膦和草铵膦不仅能防除绝大多数杂草，还能杀死与水稻亲缘关系相近的杂草稻。三酮类除草剂能很好地弥补草甘膦、草铵膦的局限和不足，形成完善的杂草防控体系。但由于常规水稻均不含这三类除草剂的抗性基因，直接施用会对水稻产生同样的毒害作用，该类除草剂目前还不能直接在水稻田大规模使用。因此，急需研发具有自主知识产权的抗草甘膦、草铵膦和三酮类除草剂的水稻新种质。

4 抗除草剂水稻育种研究进展

近年来，不少研究团队利用自然变异、化学诱变、转基因、基因编辑和自优育种等技术，针对不同类型除草剂标靶基因进行深入研究，创制了一系列抗除草剂水稻新种质。

4.1 内源基因改良抗除草剂水稻

4.1.1 通过大规模水稻品种筛选发掘自然变异抗性材料

2018年，王芳权等[25]通过大规模咪唑乙烟酸抗性筛选，从7 000 多份水稻材料中筛选出1 个抗该除草剂的水稻材料Jinjing818。2020年，毕俊国等[26]通过除草剂抗性筛选，从30 570 份水稻资源中挖掘出1 份抗咪唑啉酮类除草剂的水稻新种质。

4.1.2 通过化学诱变创制具有不同除草剂抗性的水稻突变体

2012年，陈竹锋等[27]利用EMS 诱变籼稻品种黄华占，筛选获得一批抗咪唑啉酮类突变体。2018年，张保龙团队[28]利用EMS 诱变粳稻品种Zhennuo19，获得1 个抗ACCase 类除草剂的突变体材料。该团队还利用EMS 诱变Zhendao18 等粳稻品种，筛选出多个抗咪唑啉酮的水稻新种质[29]。

4.1.3 通过CRISPR/Cas9 基因编辑技术对水稻内源基因进行定点编辑

2016年，LI 等[30]利用基因编辑技术对水稻内源基因OsEPSPS 的TIPS 位点进行定点替换，获得了抗草甘膦的水稻新种质。2015年，SUN 等[31]利用该技术在粳稻品种日本晴中定点突变OsALS 基因，获得的株系对双草醚具有良好抗性。2020年，WANG 等[32]同样利用该技术在南粳9108 中定点突变OsALS 基因，获得抗咪唑啉酮类除草剂的水稻新种质。

4.1.4 通过自身基因优化育种培育抗除草剂水稻

2016年，为解决抗除草剂“基因挖掘难”和“突变不定向”等技术难题，四川天豫兴禾生物科技有限公司从作物基因组中寻找除草剂靶标基因进行深入研究，独创多个抗除草剂基因定向进化方法[33-34]，利用该技术对靶标基因具有突变速度快、精准度好、筛选效率高的特点，成功创制出一批抗草甘膦和抗草铵膦的植物内源突变基因[35-38]，形象称之为“基因超进化”系统。

同时，为了不引入外源基因及转基因成分，根据上述突变基因的专利信息，利用PCR 技术重新对水稻OsEPSPS 野生型基因进行精准突变，突变后的OsEPSPS 基因片段，不含任何非必要突变和外源序列，未进行基因重组。将突变后的OsEPSPS 基因片段通过基因枪精准杂交到水稻品种中，获得无载体系统不含外源基因片段的抗草甘膦水稻新种质，该试验过程称为“自身基因优化育种”（简称自优育种）。由“基因超进化”创制的突变基因对草甘膦的耐受性超过田间推荐剂量20 倍，同时对其他农艺性状无不良影响，具有很大的商业化推广价值[39]。

4.2 导入外源基因获得抗除草剂水稻新品种

2014年，王云鹏等[40]通过其建立的草甘膦污染土壤宏基因组文库克隆出1 个高抗草甘膦的soil EPSPS基因，将该基因转入粳稻品种Jinongda878，获得转基因抗草甘膦的水稻新种质。2015年，梅锋[41]将抗虫基因HJC-1 和抗草甘膦基因G6-EPSPS 同时导入秀水110，获得转基因抗虫耐草甘膦水稻新种质G6H1。2017年，DONG 等[42]将来自荧光假单胞菌的G2-EPSPS 转入中花11，获得转基因的抗除草剂水稻新种质。

2013年，翁绿水等[43]将抗虫基因Cry2Aa# 和抗草铵膦基因Bar 同时转入水稻恢复系D68，培育出抗虫、耐草铵膦转基因恢复系B2A68。2016年，徐海英等[44-45]将来自不同细菌的基因Pa-HPPD、Pp-HPPD 和Ct2-HPPD 同时导入水稻材料，获得多个抗异噁唑草酮水稻新种质。2005年，KAWAHIGASHI 等[46]将3 个细胞色素P450 家族基因CYP1A1、CYP2B6 和CYP2C19 分别导入日本晴，获得抗不同类型除草剂的转基因株系。2012年，沈志成团队[47]从狗牙根中克隆了1 个细胞色素P450 基因N-Z1，并将其导入秀水134，获得分别抗烟嘧磺隆和硝磺草酮的转基因植株。

4.3 内源基因改良抗除草剂水稻应用潜力

草甘膦作为全球应用最广泛的除草剂，其巨大的市场价值使得抗草甘膦基因挖掘成为各国农业生物技术公司竞争和布局的焦点。岳荣生等[48]披露了全球抗草甘膦基因专利的申请情况。截至2020年10 月，我国抗草甘膦基因专利总量排名全球第二，其中中国农业科学院、四川天豫兴禾生物科技有限公司和先正达集团分列全球第七、八、十位，具体专利数据详见表2。目前，国内外其他申请人在抗草甘膦基因核心专利中披露的基因均来自微生物，而四川天豫兴禾生物科技有限公司通过专利技术，获得了一大批具有自主知识产权的植物内源抗草甘膦突变基因，未来具有较大的发展潜力和市场竞争优势。

表2 抗草甘膦基因专利重点申请机构情况[49]

四川天豫兴禾生物科技有限公司研发的“基因超进化”系统，能快速创制植物内源抗除草剂基因，解决了灭生性除草剂作物内源抗性基因缺失的难题[49]。该作物内源突变基因通过自优育种技术培育出多个抗草甘膦水稻新种质。同时，还能利用基因编辑系统对这些植物内源突变基因进行定点编辑，创制基因编辑抗除草剂作物，或利用转基因技术开发相应的转基因产品。自优育种抗草甘膦水稻的成功创制，能显著拓宽灭生性除草剂在稻田中的使用范围，不仅能降低水稻除草成本，还可显著降低除草剂用量。经测算，每667 m2田至少能节本增收100～200 元（减少除草成本、人工成本、田间管理成本，以及提高品质增效等）。

5 讨论与展望

农田杂草严重影响水稻产量，间接影响稻米品质，增加农民生产成本投入，影响水稻生产安全。

目前，水稻田常用除草方案均需多次施用不同类型的选择性除草剂，虽然缓解了部分杂草的危害，但对抗性杂草的防效越来越差。种植户为保证除草效果，经常加大用药剂量或重复喷药，这样不仅容易对水稻和后茬作物造成药害，杂草的抗性也呈现普遍性发生和区域性暴发；同时，除草剂滥用也导致其残留增加，引发农产品的食品安全和生态环境污染问题。

由于传统育种手段选育周期长、工作量大等问题，难以满足日益丰富的育种目标[50]。特别是水稻中对除草剂抗性基因的自然选择难度较大，鲜有通过自然选择获得高抗除草剂水稻新品种的报道。

在抗除草剂水稻创制中，研究人员主要针对广谱型除草剂的标靶基因进行研究。目前，应用比较成功的主要包括抗草甘膦、草铵膦和咪唑啉酮类除草剂水稻。巴斯夫公司、深圳洁田模式生物科技有限公司和江苏省农业科学院分别通过EMS 诱变，获得了抗咪唑啉酮类除草剂水稻Clearfield、jietian1hao 和金粳818 等。金粳系列抗咪唑烟酸水稻在江苏推广面积已达到6.7 万hm2以上，洁田系列水稻在安徽、江苏、广东都有小规模示范种植。由此可见，我国对于抗除草剂水稻的市场需求非常大。

抗咪唑啉酮类水稻无法规和政策限制，更易被大众接受。但该类除草剂残留期长，会对后茬敏感作物造成药害。同时，随着咪唑啉酮类除草剂大量使用，近年来抗性杂草数量激增，影响了咪唑啉酮类除草剂进一步推广[51]。抗草甘膦水稻和抗草铵膦水稻使用转基因技术将细菌中发现的抗性基因导入水稻中，抗草甘膦水稻虽获得了安全证书，但由于其“转基因身份”并未实际推广。

CRISPR/Cas9 基因编辑技术因操作方便、高效、高特异性和低成本等优点，目前已成功创制多个抗除草剂水稻新种质[52]。但要更好利用该编辑系统，还需要通过各种技术手段，挖掘更多优良的植物内源基因供该系统进行编辑。

抗除草剂水稻中HPPD 抑制剂类抗性基因研究还比较少。因此，需要加强抗三酮类除草剂水稻的种质创新。该类除草剂还未在我国水稻田大规模使用，与其他类型除草剂无复合抗性，三酮类除草剂与草甘膦、草铵膦配合使用，能安全、环保、完善解决抗性杂草问题。将这3 类除草剂与其对应的3 种抗性水稻配套使用，可为稻田杂草防控提供完善的解决方案，每季种植不同类型的除草剂抗性水稻并搭配对应的除草剂，在防控稻田杂草和抗性杂草的同时，完善解决农药残留、食品安全和生态环境等诸多问题，有效促进水稻直播技术的快速发展，在提高水稻生产经济、社会、生态效益方面具有重要意义。