m6A修饰在卵巢癌中的研究进展

彭佳欣 张自辉 洪莉

武汉大学人民医院妇产科（武汉 430060）

卵巢癌是常见的妇科恶性肿瘤之一，也是妇科恶性肿瘤的最主要死亡原因。根据组织病理学，卵巢癌分为上皮性卵巢癌、性索间质瘤和生殖细胞肿瘤等［1］。由于卵巢癌患者早期无特异性症状和体征，多数患者就诊时已属晚期。此外，化疗耐药亦是卵巢癌患者预后不良的最重要因素之一［2-3］。研究表明，卵巢癌在Ⅰ期诊断时，所有组织学亚型的5 年生存率约为90%，然而，大多数卵巢癌直到Ⅲ期（51%）或Ⅳ期（29%）才首次确诊，全球卵巢癌患者5 年生存率低于30%［1，4］。因此，探索卵巢癌恶性进展、化疗耐药等相关机制对于靶向治疗卵巢癌、改善患者预后具有积极作用。

近年来研究表明，表观遗传修饰广泛参与卵巢癌的恶性进展［1］。m6A（N6-甲基腺苷）修饰是一种常见的表观遗传学修饰，有研究发现，m6A 修饰在卵巢癌中具有关键的调控作用，且m6A 修饰相关基因的表达与卵巢癌的恶性表型及预后不良有关［5-6］。因此，m6A 修饰相关基因有望成为卵巢癌的潜在分子治疗靶点。本文综述了m6A 修饰在卵巢癌中的相关研究进展。

1 m6A 修饰概述

m6A 修饰主要通过3 种不同类型的调节因子调节基因的表达水平，包括甲基转移酶（“Writers”）、去甲基化酶（“Erasers”）和RNA 结合蛋白（“Readers”），m6A 修饰具有动态性和可逆性特点［5-6］。其涉及RNA 代谢的各个方面，包括RNA剪接、miRNA 加工、核输出、翻译和RNA 降解。已研究确定了10 个甲基转移酶基因、3 个去甲基化酶基因和12 个RNA 结合蛋白基因［7-9］，相关基因及调控功能见表1、图1［6］。

图1 m6A 修饰因子在调控RNA 修饰的功能作用Fig.1 The role of m6A regulatory factors in regulating RNA modifications

表1 m6A 修饰因子在调控RNA 修饰的功能作用Tab.1 The role of m6A regulatory factors in regulating RNA modifications

1.1 m6A 甲基转移酶m6A 甲基化由几种蛋白质组成的甲基转移酶复合物（MTC）催化。甲基转移酶样蛋白3（METTL3）是一种S-腺苷甲硫氨酸（SAM）结合蛋白，METTL3 是m6A MTC 最重要的组成部分。甲基转移酶样蛋白14（METTL14）是m6A MTC 的另一种活性成分，METTL3 和METTL14 共定位在核斑点中，并以1∶1 的比例形成稳定的复合物发挥调控作用［10］。WT1 相关蛋白（WTAP）主要通过将METTL3 和METTL14 募集到核斑点中来促进m6A 甲基化［11］。RNA 结合基序蛋白15（RBM15）和RNA结合基序蛋白15B（RBM15B）可以结合METTL3 和WTAP 并将这两种蛋白质引导至特定的RNA 位点进行m6A 修饰［7］。VIRMA/KIAA1429 招募MTC 并介导mRNA 中3＇UTR 和终止密码子区域附近腺嘌呤碱基的甲基化，此外，还与多腺苷酸化特异性因子亚基5（CPSF5）及多腺苷酸化特异性因子亚基6（CPSF6）相互作用进行m6A 甲基化修饰［7］。其他m6A 相关甲基化转移酶，如VIRMA、RBM15 及其旁系同源物RBM15B 和ZC3H13 等，已被发现是m6A 甲基转移酶复合物的重要组成部分［12］。总之，每一种m6A 甲基化转移酶对于m6A 修饰的过程都是必不可少的。

1.2 m6A 去甲基化酶在去甲基转移酶方面，FTO和ALKBH5 都属于α-酮戊二酸依赖性双加氧酶家族，以铁（ii）和α-酮戊二酸依赖的方式催化m6A去甲基化。FTO 或ALKBH5 的缺乏或过表达均会改变细胞的m6A 修饰水平［12］。研究表明，ALKBH3 主要调控tRNA 中的m6A 修饰，而不是mRNA或rRNA［12］。m6A 甲基化转移酶与m6A 去甲基化酶之间的功能相互作用决定了m6A 修饰的动态和可逆调控。

1.3 m6A 结合蛋白关于m6A 相关的RNA 结合蛋白的研究表明，m6A 修饰需要RNA 结合蛋白（“Readers”）识别，从而调控基因的表达和生物学功能。核RNA 结合蛋白包括YTHDC1、HNRNPA2B1、HNRNPC11 和HNRNPG，而细胞质RNA 结合蛋白包括YTHDF1/2/3、YTHDC2 和IGF2BP1/2/3［8］。不同的RNA 结合蛋白根据不同的细胞环境、细胞定位呈现不同甚至相反的生物学功能。YT521-B 同源（YTH）域家族的成员，包括YTHDF1、YTHDF2、YTHDF3、YTHDC1 和YTHDC2，都具有保守的m6A结合域，并通过结合RRm6ACH 共有序列进行m6A修饰［12］。YTHDC1 与SRSF3 和NXF1 相互作用，促进m6A 甲基化mRNA 的核输出［13］。除了YTH 域家族，异质核核糖核蛋白（HNRNP）家族的某些成员也可作为m6ARNA 结合蛋白。HNRNPA2B1 首次被鉴定为一种特异性m6A 结合蛋白，通过结合m6A甲基化转录本促进初级miRNA加工和成熟［14］。此外，HNRNPC 和HNRNPG 通过m6A 修饰的RNA转录来调节mRNA 丰度和剪接［12］。胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白（IGF2BPs，包括IGF2BP1/2/3）也可以识别m6A 修饰，与YTHDF2 降低mRNA 稳定性功能相反，IGF2BPs 以m6A 依赖性方式促进其靶mRNA 的稳定性，从而影响基因调控和生物学功能［12，15］。综上，RNA 结合蛋白可以通过调节多种过程来调节基因表达，例如调控mRNA 稳定性、mRNA 剪接、mRNA 结构、mRNA 输出、改变翻译效率和miRNA 生物发生［8］。

2 m6A 修饰因子在卵巢癌中的表达及预后意义

HAN 等［16］基于TCGA 数据库分析了579 例卵巢癌患者基因突变和拷贝数变异（CNV）数据，结果发现m6A 相关CNV 基因数量与组织学分级和TP53 突变呈正相关，并且几乎所有卵巢癌患者（99.31%）的CNVs 至少有1 个m6A 调节基因发生突变，而83.76%的病例显示CNVs 同时存在4 个以上m6A 调节基因突变，其中ALKBH5（88.26%，511/579）是CNV 事件频率最高的基因，其次是WTAP（76.86%，445/579）。ZHU 等［17］基于TCGA 数据库分析了13 个m6A 基因在卵巢癌组织的表达水平，结果发现ZC3H13、ALKBH5、RBM15、YTHDF1和YTHDF2 在卵巢癌组织中高表达，而WTAP、HNRNPC、METTL3、YTHDC1/2、KIAA1429、METTL14、FTO 在卵巢癌组织中低表达，且KIAA1429和YTHDC2 高表达患者预后不良。WANG 等［18］研究发现，7 个RNA 结合蛋白（HNRNPC、IGF2BP1、IGF2BP2、IGF2BP3、RBMX、YTHDC2 和YTHDF2）和3 个甲基转移酶（METTL3、RBM15 和RBM15B）在卵巢癌中的表达增加，而YTHDC1 和RBM15 表达上调与卵巢癌细胞转移有关，HNRNPC 是紫杉醇耐药的预测因子。以上研究表明，m6A 修饰相关基因的表达与卵巢癌的组织学分级密切相关，在侵袭转移、化疗耐药过程中有重要作用，其可能作为评估预测卵巢癌预后的重要方法之一［16-19］，然而，由于样本量不足及缺乏相关实验进行验证，m6A 修饰基因的表达能否作为卵巢癌的早期诊断和评估预后的标志物仍需更多的实验研究。

3 m6A 修饰因子参与卵巢癌恶性进展的机制

3.1 甲基转移酶（“Writers”）与卵巢癌一项关于METTL3 在多肿瘤包括胃癌、乳腺癌、非小细胞肺癌、膀胱癌、结直肠癌和卵巢癌在内的1 257 例患者的荟萃分析表明，女性的METTL3 表达高于男性，并且高METTL3 表达与较差的分化相关［20］。另一项研究表明，METTL3 在卵巢癌中高表达，且与肿瘤组织学分级（P=0.001）、FIGO 分期（P＜0.001）和总生存率（P＜0.001）较差相关［20］。机制研究表明，METTL3 通过上调受体酪氨酸激酶AXL 促进上皮间质转化（EMT）从而促进卵巢癌的生长和侵袭［20］。另一项研究表明，METTL3 通过miR-126-5p/PTEN 介导的PI3K/Akt/mTOR 通路促进卵巢癌进展［21］。此外，METTL3 还可通过促进pri-microRNA-1246 成熟抑制CCNG2 表达促进卵巢癌的发生和转移［22］。有研究表明，METTL14 的下调通过稳定肌钙蛋白相关蛋白（TROAP）mRNA 促进卵巢癌细胞增殖［23］。WTAP 在高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）中的高表达与淋巴结转移显着相关（P＜0.05）、较短的总生存期（P＜0.01）显著相关，其机制可能与MAPK 和AKT 通路激活有关［24］。另一项研究亦证实，WTAP 的高表达预示着卵巢癌患者预后不良，机制可能与WTAP 和DGCR8 相互作用，以依赖m6A 的方式调节microRNA-200（miR-200）和HK2 的表达，从而影响卵巢癌Warburg 效应和肿瘤进展［25］。此外，UBA6-AS1 通过募集RBM15 增加卵巢癌UBA6 mRNA 的m6A 甲基化和恶性进展［26］。MALAT1 在人卵巢恶性肿瘤组织高表达，且与卵巢癌患者较差的总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）相关［27］。其机制可能与MALAT1 高表达导致miR-143-3p 表达降低和CMPK 蛋白表达增加有关［27］。另有研究表明，MALAT1 过表达通过调控炎症相关通路（IL-1β、p-P38/p-NFκB/Cox2 和PGE2）PI3K 通路（p-PI3K 和p-Akt）和EMT 通路（ZEB2、YAP、vimentin 和E-钙粘蛋白）等促进卵巢癌肿瘤微环境中的化疗耐药性和恶性进展［28］。此外，MALAT1 还可通过其他机制促进卵巢癌的恶性进展及化疗耐药，例如调控miR-503-5p/JAK2/STAT3通路［29］、抑制YAP 核质易位和促进YAP 蛋白的稳定性和表达［30］、调控miR-1271-5p/E2F5 通路［30］、Wnt/β-catenin 信号通路［31］、Notch1 信号通路［32］等。综上，甲基转移酶可通过影响多种与卵巢癌发生、侵袭转移和化疗耐药等相关通路，从而参与促进卵巢癌的恶性进展。然而，仍有部分甲基转移酶（例如VIRMA、RBM15B、ZC3H13 和KIAA1429 等）参与卵巢癌进展的机制目前未明，有待进一步研究。

3.2 RNA结合蛋白（“Readers”）与卵巢癌YTHDF1在卵巢癌中高表达，且与卵巢癌不良预后密切相关，机制研究表明YTHDF1 通过与m6A 修饰的EIF3C mRNA 结合以m6A 依赖性方式增强EIF3C表达，从而促进卵巢癌的肿瘤发生和转移［33］。有研究表明TRIM29 表达增加与卵巢癌患者预后不良有关，而这与YTHDF1 促进TRIM29 m6A 修饰参与促进顺铂耐药卵巢癌细胞中的TRIM29 翻译及癌症干细胞（CSC）干性有关［34］。与正常卵巢组织相比，卵巢癌组织中的YTHDF2 显著上调，m6A 甲基化水平降低，这可能与miR-145 负调控相关［35］。另一项研究表明，肿瘤抑制因子FBW7 是SCFE3-泛素连接酶复合物的底物识别成分，可介导各种癌蛋白的降解，而FBW7 高表达与卵巢癌良好的预后和m6A 修饰水平增加相关，FBW7 通过诱导YTHDF2 在卵巢癌中的蛋白酶体降解来抑制YTHDF2 的促肿瘤作用［36］。研究显示，HNRNPA2B1 在卵巢癌中表达增加，且与不良预后有关，可能与上调Lin28B 的表达抑制癌细胞凋亡并促进恶性进展有关［37］。卵巢癌顺铂化疗耐药与HNRNPA2B1 通过促进募集ABCC2 mRNA 的5＇UTR 并促进ABCC2 的表达有关［38］。而miR-744-5p 通过下调了核因子IX（NFIX）和HNRNPC 的表达，抑制p-AKT和Bcl-2 表达，从而促进癌细胞凋亡［39］。IGF2BP1在高级别浆液性卵巢癌中表达上调，这与激活IGF2BP1-SRC/ERK2 轴促进上皮间质转化有关［40］。有研究表明，IGF2BP2 可通过microRNA-3187-3p/ERBB4/PI3K/AKT 轴增强circ_0000745 丰度并促进卵巢癌细胞的侵袭性和干性［41］。此外，circ-0001756可通过IGF2BP2介导的RAB5A表达和EGFR/MAPK信号通路促进卵巢癌进展［42］。而circ-PBX3 可通过与IGF2BP2 相互作用并稳定ATP7A mRNA 表达促进顺铂耐药［43］。一项328 个卵巢癌透明细胞癌IGF2BP3 表达和临床病理特征分析表明，IGFBP3是卵巢透明细胞癌的生物标志物，且与卵巢癌患者预后不良（HR= 1.59，95%CI：1.09～2.33）和化疗耐药有关［44-45］。另一项研究显示，IGF2BP3 通过稳定的SIX4 表达促进SKOV3 细胞的增殖、转移和血管生成［46］。总之，RNA 结合蛋白可通过不同机制促进或抑制卵巢癌的恶性进展，但建立特定RNA结合蛋白、分子机制和表型之间的桥梁仍需要进一步研究。

3.3 去甲基化酶（“Erasers”）与卵巢癌目前研究主要发现了3 种去甲基转移酶，包括FTO、ALKBH3 和ALKBH5 等。去甲基化酶对于调控m6A 修饰的动态性和可逆性至关重要。研究表明，FTO可通过依赖性m6A 修饰阻断cAMP 信号传导并抑制卵巢癌干细胞干性及肿瘤进展［47］。ALKBH3 通过诱导的m1A 去甲基化增加卵巢癌CSF-1 mRNA的稳定性和侵袭性［48］，而ALKBH5 通过激活TLR4/NF-κB 通路促进卵巢癌进展［49］。目前仅发现并验证了3 种去甲基化酶，但是是否有未知的去甲基化酶仍有待进一步研究，此外，关于FTO、ALKBH3和ALKBH5 参与调控卵巢癌的机制仍不深入，有待进一步阐明。目前关于m6A 修饰参与卵巢癌进展的机制研究总结见表2。

表2 m6A 修饰在卵巢癌中的作用机制研究Tab.2 The regulatory mechanism of m6A modification in ovarian cancer

4 靶向m6A 修饰是抗卵巢癌的潜在策略之一

关于m6A 修饰的靶向策略的早期研究主要集中在去甲基化酶上。ALKBH5 和FTO 通过与其辅助因子和底物相互作用发挥其功能，这些辅助因子和底物可被FTO 或ALKBH5 抑制剂（如大黄酸、甲氯芬那酸、恩他卡朋等）所阻断［50］。甲氯芬那酸和恩他卡朋联合伊马替尼已进入胃肠道间质瘤复发转移的临床试验，这显示了靶向m6A 修饰治疗晚期或复发性癌症的可能性［50］。Radicicol，一种Hsp90 抑制剂，亦可作为FTO 的抑制剂并增强肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配体（TRAIL）诱导的细胞凋亡［51］。也有多项研究显示多种小分子化合物可直接靶向METTL3，例如STM2457 和UZH1a，这两种抑制剂都通过占据SAM 结合位点并重组METTL3 的Lys513，从而显示出靶向特异性［52］。研究表明，STM2457 和UZH1a 均可抑制AML 细胞系MOLM-13 的METTL3 活性，发挥抗肿瘤作用［52］。此外，m6 A 修饰的可变剪接是mRNA 加工的关键步骤，参与肿瘤侵袭、增殖、代谢和耐药性［5］。例如，m6A 修饰JAK2、FZD10 和TRIM29 的可变剪接与卵巢癌PARP 和顺铂抗性密切相关，这可能是靶向剪接逆转PARP 和顺铂耐药的重要策略之一［5］。另一种靶向m6A 修饰是通过治疗性寡核苷酸抑制相关基因的表达，其中部分抗肿瘤寡核苷酸已进入临床试验，包括Apatorsen、AZD9150、AZD5312和EZN-4176 等［5］，然而，关于治疗性寡核苷酸通过改变m6A 修饰抑制卵巢癌的进展的研究仍不足。将该技术应用于卵巢癌的治疗也存在一定问题。例如，选择靶向哪种m6A 修饰的mRNA？如何特异性靶向m6A 修饰的mRNA？虽然目前关于靶向卵巢癌m6A 修饰，增强化疗敏感性抑制肿瘤恶性进展的研究较少，但考虑m6A 修饰在卵巢癌中的重要作用，靶向m6A 修饰仍是抗卵巢癌的潜在策略之一。此外，有研究通过建立预后模型，发现YTHDC2 和KIAA1429 两种m6A 甲基化调节基因与卵巢癌患者预后显著相关，但模型未经过外部数据的验证，未来有必要进行进一步研究验证此研究结果［17］。

5 总结

大量研究已表明，m6A 修饰广泛参与卵巢癌的增殖、侵袭、转移及化疗耐药等过程，但是关于m6A 修饰调控卵巢癌恶性进展的确切机制和调控关系有待进一步研究，此外，如何靶向m6A 修饰抑制卵巢癌的恶性进展及逆转化疗耐药亦是今后的研究方向之一。总之，进一步的研究将增加对m6A 修饰在卵巢癌中的生物学功能的认识，以期为卵巢癌患者的靶向治疗提供新的策略。