85525例无创产前检测发现罕见常染色体三体结果分析

张苗苗 方玉琴 李景然 王朝红 孙玉秀 朱健生

安徽医科大学附属妇幼保健院（合肥 230000）

无创产前检测（noninvasive prenatal testing，NIPT）自问世以来，以分析孕妇外周血中的胎儿游离DNA（cell-free foetal DNA，cffDNA）为基础，在产前诊断领域迅速推广［1］。由于NIPT 方法的全基因组性质，已经扩大了筛查范围，不可避免地会发现罕见常染色体三体（rare autosomal trisomies，RATs），定义为21、18 或13 号染色体以外的常染色体三体，但是对于RATs 的研究较少，其应用价值尚存争议，还需要更多的验证证据［2-3］。其次，RATs 并不罕见，在产科人群中检测到RATs 的频率为0.18%左右，NIPT 对RATs 的阳性预测值（positive predictive value，PPV）较低（4%～6%）［4］，假阳性高的主要原因为限制性胎盘嵌合（confined placental mosaicism，CPM）的存在，导致RATs 高风险通常与胎儿-胎盘疾病风险增加相关［5］，但是，关于RATs 的发病率和妊娠结局的报道仍然有限，出于这个原因，这种意外的发现通常会使遗传咨询变得困难，了解RATs 临床意义的必要性已经变得迫切。因此，本研究纳入了目前国内最大的样本量，旨在探讨NIPT 在筛查RATs 的准确性以及RATs 高风险的孕妇是否会发生不良妊娠结局，首次对RATs 进行各条染色体的详细分析，评估不同染色体之间存在的差异，以期帮助改善妊娠管理。

1 资料与方法

1.1 研究对象收集2018年1月1日至2022年6月1 日在安徽省妇幼保健院接受NIPT 的85 525 例孕妇（年龄：18～35 岁），纳入标准如下：（1）孕周12+0～26+5；（2）单胎妊娠；（3）孕妇血清学筛查临界风险值（1/1 000 ≤T21＜1/270，1/1 000 ≤T18＜1/350），孕妇血清学筛查高危值（T21 ≥1/270，T18 ≥1/350）；（4）B 超提示胎儿单项软指标异常。排除标准如下：（1）胎龄＜12 周；（2）双胎或者多胎妊娠；（3）B 超显示胎儿结构畸形；（4）配偶其中一方明确染色体异常；（5）1年以内接受过异体输血、干细胞治疗、移植手术或免疫治疗的孕妇；（6）患有恶性肿瘤的孕妇；（7）因严重溶血、凝血、游离DNA 含量低等原因复检不合格的样本。本研究得到了安徽医科大学伦理委员会的批准。所有患者在检测前进行临床遗传学家的咨询，并在采血前签署知情同意书。

1.2 检测方法

1.2.1 NIPT 检测NIPT 使用无菌EDTA 抗凝管采集每位孕妇外周血5 mL，在安徽省妇幼保健院遗传实验室进行两步离心法，分离血浆，使用QIAAMP 循环核酸试剂盒（QIAGEN）磁珠吸附提取法提取DNA，随后用末端修复酶进行末端修复，标记接头并用连接酶连接接头，最后通过聚合酶链式反应将DNA 扩增到所需的浓度完成文库构建；利用NextSeqCN500 测序仪进行高通量测序和生物信息学分析，并与人类基因组参考序列图进行比较，NIPT 结果以Z 值风险评分表示：评分≥3或≤-3 被认为是高风险，评分-3～3 被认为是低风险。

1.2.2 侵入性产前诊断

1.2.2.1 染色体核型分析在超声引导下进行羊水穿刺术，抽取20～30 mL 羊水，进行接种、培养、G 显带，使用GSL-120 型自动核型扫描仪进行核型扫描。根据《国际人类细胞遗传学命名系统，ISCN2020》指南进行核型描述。

1.2.2.2 染色体微阵列分析（chromosomal microarray analysis，CMA）同上采集羊水细胞后，进行离心沉淀，提取DNA，根据AffymetrixCytoScan 750K 芯片操作规程，进行SNP 芯片检测，收集数据，参考公共数据库（Clingen、Decpher、ClinVar、OMIM、DGV、ISCA、NCBI、UCSC）中的文献进行综合分析。

1.2.3 随访所有孕妇均通过电话或电子病历系统进行随访，随访内容包括分娩记录、实验室筛查、胎儿超声检查、细胞遗传学测试和新生儿体检报告。结果衡量标准：根据出生孕周，新生儿分为足月儿（≥37 周）、早产儿（preterm birth，PTB）（32～37 周）和极早产儿（＜32 周）；胎儿生长受限（fetal growth restriction，FGR）的标准依据新生儿出生体重低于同孕龄正常体重的第10 百分位数［5-6］。

2 结果

2.1 RATs 高风险的NIPT 结果85 525 例孕妇中筛查出182 例RATs 高风险，频率为0.21%（182/85 525），按降序排列，T7（7 号染色体三体）、T8、T16和T20 较常见（≥15 例）；T10、T9、T3、T2、T11、T15、和T22 中等频率（5～15 例）；T14、T17、T1、T5、T6和T12 相对少见（＜5 例）；未检测出T4 和T19。见图1。

图1 NIPT 检出RATs 在不同染色体上的分布Fig.1 The distribution of RATs on different chromosomes by NIPT

2.2 RATs 高风险的产前诊断结果182 例孕妇经过详细的遗传咨询，46 例拒绝侵入性产前诊断，其余136 例进行羊膜腔穿刺术，行羊水核型分析或CMA 检测，检测出7 例真阳性（PPV：5.15%），分别为两例T2、1 例T9、1 例T7、1 例T15 和2 例T16。PPV 分别为50.0%（2/4）、3.13%（1/32）、12.5%（1/8）、33.3%（1/3）和12.5%（2/16），其他染色体的PPV 均为0.00%，总PPV 为5.15%。见表1。

表1 孕妇行NIPT 及侵入性产前诊断的结果Tab.1 Results of NIPT and invasive prenatal diagnosis in pregnant women 例

行CMA 检测的孕妇中发现了5 例杂合性缺失（loss of heterozygosity，LOH），1 例LOH（6），CMA 结果为6p25.3p22.3 区域15.57 Mb 及6q24.3q27 区域22.15 Mb 杂合性缺失，进一步家系验证为母源性单亲二倍体（uniparentaldisomy，UPD）；1 例LOH（10），CMA 结果为10 号染色体杂合性缺失；2 例LOH（16），CMA 结果分别为16q21q24.3 区域24.45 Mb和16p13.3 区域5.91 Mb 杂合性缺失；1 例LOH（20），芯片结果为20P12.3P11.1 区域20.91 Mb 及20q11.21q13.33 区域29.06 Mb 杂合性缺失，进一步家系验证，结果为父源性UPD。

2.3 RATs 高风险孕妇的妊娠结局在182 例RATs 高风险的孕妇中获得121 例详细随访信息，在不考虑单个染色体的情况下，121 例孕妇中有46 例（38.02%）发生不良妊娠，主要表现在FGR 和PTB，发生率分别为25.62%（31/121）和20.66%（25/121），明显高于以往报道（6.39%和7.1%）［6-7］。值得关注的是，我们发现不良妊娠的发生率在不同染色体之间存在差异，例如在1、2、3、6、15、16、22 号染色体上较高（≥50%），而5、14、17 号染色体没有发生。其次，16 号染色体的病例数较多且不良妊娠特征较为明显，发生率高达89.5%（17/19），19例孕妇中9 例（47.4%）出现早产，12 例（63.2%）出现FGR，见表2、3。

表2 121 例RATs 高风险孕妇的妊娠结局Tab.2 Pregnancy outcomes of 121 pregnant women at high risk of RATs 例

表3 孕妇的妊娠结局在不同染色体上的分布Tab.3 Distribution of pregnant women＇s pregnancy outcomes on different chromosomes 例

3 讨论

与传统的血清学筛查相比，NIPT 以其无创性、高准确性和妊娠范围广等优势快速成为一种常见的产前筛查方式［8］，对21、18 和13 号染色体非整倍体的筛查具有较高的敏感性和特异性［9-10］，然而针对RATs 的数据量很少，临床处理需要更多的数据支持。VAN 等［11］发现RATs 作为一个群体比T13 更常见，几乎和T18 一样常见，但是NIPT 检测RATs 的准确性以及RATs 高风险与不良妊娠结局的相关性具有不明确性［12］，孕妇需要在侵入性产前诊断的已知风险和妊娠结局的未知影响之间进行权衡，导致遗传咨询充满挑战。因此，我们对此类数据进行研究，有助于改善妊娠管理。

本研究发现，NIPT 样本中RATs 的频率为0.21%，最常见是T7、T8、T16 和T20，这与BENNP等［13］的观察相似，PPV 分别为3.13%、0.00%、12.5%和0.00%，总PPV 仅为5.15%。PPV 较低的原因：（1）染色体异常仅发生在胎盘而不发生在胎儿，称为CPM［14］。在细胞发育过程中，由于有丝分裂或者减数分裂发生错误导致合子形成染色体三体，这在怀孕早期是致命的，只有合子发生“三体挽救”形成CPM，大部分胎儿才能继续存活［15-16］。QI 等［17-18］发现，T7、T8 病例伴随正常的羊膜腔穿刺术几乎可以肯定地解释为CPM。（2）合子发生三体挽救时，3 条染色体中的每一条都有同样的丢失机会，如果剩下的两条染色体来自同一个亲本，就会产生UPD，UPD 不涉及染色体剂量的增加，NIPT 很难检测到，但是6、7、11、14、15 或20 号染色体上的印记基因会产生不良临床后果［19-20］。在我们的研究中发现了2 例UPD，1 例母源性UPD（6），尚无明确印迹疾病，孕妇选择继续妊娠；1 例父源性UPD（20），与假性甲状旁腺功能减退症相关［21］，孕妇选择引产。UPD 的检出率分别为50%（1/2）和9.09%（1/11），见表4。由此可见，NIPT 检测到的RATs 很可能是假阳性的，但是RATs 高风险导致患UPD 的风险增加，尽管没有超声异常，印迹基因的不利影响仍存在。因此，NIPT 提示6、7、11、14、15 或20 号染色体三体时，建议孕妇进行侵入性检测，另一方面，如果不涉及印迹基因，应该谨慎使用侵入性手术，但考虑到TFM 的存在需要增强超声随访。

表4 羊水细胞中UPD 的检出率及临床表现Tab.4 Detection rate of UPD in amniotic fluid cells and clinical manifestation 例

其次，NIPT 检测的cffDNA 来源于绒毛滋养层细胞，在产前阶段，“胎儿游离DNA”被称为“胎盘游离DNA”或许更加准确［22］，cffDNA 作为一种新的生物标志物，可以预测胎盘的健康与疾病，RATs 高风险可能与胎儿宫内死亡、FGR 和胎儿畸形等妊娠结局相关［13，23］。在本研究中，121 例RATs 高风险的孕妇中有46 例（38.02%）发生不良妊娠，但是，大部分孕妇获得了活产（95.87%），不良妊娠主要体现在FGR（25.62%）和PTB（20.66%）。此外，在后续的妊娠管理中对于不同的染色体很可能不同，1、2、3、6、15、16 和22 号染色体的不良妊娠发生率较高（＞50%），尤其是16 号染色体FGR 和PTB 显著高于总体组。出现这种现象的主要原因是：NIPT 筛查发现的RATs 通常局限于胎盘，根据受累组织的分布，CPM 分为CPM 1、2、3 型。由于cffDNA 来源于滋养层细胞，因此，只有CPM 1和3 型可以被NIPT 识别。CPM 1 型主要导致自然流产或宫内死亡，CPM 3 型容易引起FGR、PTB 等不良结局。15 和16 号染色体主要在CPM 3 型中检测到，因此出现了围产期高比例的不良妊娠结局，对于与RATs 高风险的孕妇妊娠期间的管理应基于具体染色体［4，15，24-25］。由此可见，对于NIPT 筛查RATs 高风险的孕妇，尽管大部分获得了活产，核型和CMA 结果也可能正常，但是患FGR 和PTB 的风险增加，需要进行连续地超声检查以监测胎儿的生长发育。

我们将85 525 例数据汇集在一起，以确定在RATs 中哪些染色体最常见，并回顾了妊娠结局，评估了受累染色体、真阳性和UPD 的存在。本研究的优势：（1）数据量较大，分析了RATs 在各条染色体上的差异。我们发现不同染色体对妊娠管理的好处是不同的，比如16 号染色体和涉及印记基因的染色体。（2）获得了较完整的产妇信息包括新生儿的发育情况，以便分析RATs 与妊娠结局的相关性，目前国内的文章因缺乏后续的随访或者样本量较少而没有这方面的研究，导致过度诊断，众所周知，羊水穿刺术是存在流产和感染的风险，我们探讨了是否需要进行这项检查，帮助缓解孕妇的焦虑。本研究的局限：（1）无法获得胎盘的遗传学检测。（2）个别染色体的病例数仍然较少，可能无法得出关于异常风险的结论，但是通过数据的不断积累有助于之后的研究。

综上所述，NIPT 筛查RATs 的PPV 较低，应谨慎使用侵入性检测，但是如果涉及印迹基因，则建议进行侵入性手术。另一方面，RATs 高风险具有重要的临床意义，它提示孕妇患FGR 和PTB 的风险增加，尤其是16 号染色体，需要增强超声检查以监测胎儿的生长发育。