丹参对野百合碱诱导肺动脉高压大鼠肺动脉压及氧化应激的影响

王 琳,闫海峰,高 宁,韩宜晓,王 帅,张泽宇,贾壮壮,李明伟,毛静远

(1. 天津中医药大学第一附属医院/国家中医针灸临床医学研究中心,天津 300381;2. 天津中医药大学,天津 301617;3. 河南中医药大学第一附属医院,河南 郑州 450000)

肺动脉高压是一种以血管阻力持续性升高和血管收缩重塑为特征的进展性疾病,最终导致右心衰竭甚至死亡［1-2］。研究显示,氧化应激与肺动脉高压发生发展密切相关,超氧化物歧化酶(SOD)等抗氧化酶和活性氧簇(ROS)参与其中,SOD抑制作用减弱及ROS产生和消除失衡可对组织和细胞直接造成氧化损伤,启动氧化还原信号途径,促进肺动脉平滑肌增殖,导致肺血管重塑［3-6］。因此,干预抗氧化酶活性及氧化产物水平可能成为治疗肺动脉高压的有效路径。丹参是唇形科植物Salvia miltiorrhiza Bge的干燥根及根茎,具有活血通经、祛瘀止痛等功效,广泛用于心血管疾病的治疗。相关研究表明,丹参能够有效抑制肺小血管的增生与重塑［7-9］,抵抗去甲肾上腺素引起的肺血管收缩［10-12］,但其作用机制尚不明确。本研究拟从氧化应激角度探讨丹参治疗肺动脉高压可能的作用机制,以期为肺动脉高压的中医药治疗提供借鉴。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 24只健康清洁级雄性SD大鼠,体重230～250 g,购于北京斯贝福生物技术有限公司,许可证编号:SCXK(京)2019-0010,饲养于中国医学科学院放射医学研究所动物中心,环境温度20～24 ℃,相对湿度40%～70%,12 h/12 h昼夜光照。适应性饲养7 d后开始实验。

1.2主要药物与试剂 丹参饮片由天津中医药大学第一附属医院药房煎煮浓缩,低剂量含生药0.585 g/mL,高剂量含生药1.17 g/mL;野百合碱(Med Chem Express公司),规格:5 g,批号:45254;叔戊醇(上海麦克林生化科技有限公司),规格:100 mL,批号:C10187107;三溴乙醇(Sigma公司),批号:MKCM1060;肝素生理盐水(1∶500);无水乙醇(天津渤化化学试剂有限公司),规格:500 mL,批号:190909。

1.3主要器械及仪器 Power Lab 8/35多导生理仪及其配套压力换能器(埃德仪器国际贸易有限公司),TAT FAX2100全自动酶标仪(德国Thermo Scientific),数显式电热恒温水浴锅(上海跃进医疗器械有限公司),精密电子天平(梅特勒-托利多仪器有限公司),超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司),PE50导管(外径0.9 mm,内径0.5 mm)。

1.4实验方法 随机选取6只大鼠作为对照组,单次腹腔注射空白溶剂0.3 mL/100 g(无水乙醇∶生理盐水=2∶8);其余大鼠均单次腹腔注射野百合碱60 mg/kg(0.3 mL/100 g,浓度为2%)诱导14 d制备肺动脉高压模型,将造模成功的大鼠随机分为模型组、丹参低剂量组、丹参高剂量组,每组6只。对照组及模型组给予空白溶剂蒸馏水1 mL/100 g灌胃,丹参低、高剂量组分别给予0.585 g/mL、1.17 g/mL丹参溶液1 mL/100 g灌胃,均每日1次,灌胃14 d,各组大鼠隔日称1次体重,根据体重变化调整给药量。

1.5检测指标及方法

1.5.1血流动力学和右心室肥厚指数(RVHI) 灌胃14 d后,按照大鼠体重比例用1.5%的三溴乙醇(0.8 mL/100 g)腹腔麻醉,仰卧位固定大鼠,分离右颈外静脉,远心端用细棉线结扎,近心端打松结备用。用眼科剪朝心室方向剪一长度2～3 mm的V形切口,将自制90°弯曲的1 mL注射器针头插入静脉,在其引导下插入导管,同时扎紧近心端棉线,以防出血。打开电脑记录软件,轻轻旋转推进导管,根据波形变化判断导管所达具体位置,记录右心室收缩压(RVSP)、平均肺动脉压(mPAP)及肺动脉波形。检测完毕后,剖开大鼠腹腔,腹主动脉取血。并用50 mL注射器吸取预冷的生理盐水,开胸后从下腔静脉缓推以冲洗干净心肺中的血液,快速剪取心肺,并沿室间隔分离左右心室,称重以计算RVHI,RVHI=右室重量/左室及室间隔重量。

1.5.2肺组织HE染色病理形态 取左肺中上叶,用生理盐水漂洗,固定于4%的多聚甲醛中72 h,将标本沿肺门横切(4 μm),经脱水、透明、浸蜡、包埋、苏木精-伊红染色,封片,光镜下观察肺血管病理形态。每张切片选择100～200 μm肺小动脉,使用Image J软件测其内径、外径、管腔面积、血管总面积,计算血管壁厚度系数［(血管外径-管腔内径)×0.5/血管外径］和血管壁面积系数［(血管总面积-管腔面积)/血管总面积］,以评估肺小动脉中膜增厚程度和肺小动脉肌化程度。

1.5.3血清SOD及ROS含量 将大鼠血液室温下静置30 min,3 500 r/min离心15 min,取上层血清,依次放入标记好的EP管中,于-80 ℃保存备用。之后严格按照ELISA试剂盒说明书,测定SOD及ROS含量。

2 结 果

2.1各组大鼠RVSP、mPAP及RVHI比较 模型组大鼠RVSP、mPAP及RVHI均明显高于对照组(P均<0.05);丹参低、高剂量组大鼠RVSP、mPAP及RVHI均明显低于模型组(P均<0.05),丹参低、高剂量组间RVSP、mPAP及RVHI比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 对照组和肺动脉高压各组大鼠RVSP、mPAP、RVHI比较

2.2各组大鼠肺组织病理形态 光镜下观察,对照组大鼠肺血管管壁结构清晰,排列整齐,厚度正常;模型组大鼠肺小动脉内膜破坏,血管壁呈不规则增厚,管腔有效面积明显减小,肺小动脉血管壁厚度系数和面积系数均明显高于对照组(P均<0.05);与模型组比较,丹参低、高剂量组大鼠肺形态学变化明显减轻,肺小动脉血管壁厚度系数和面积系数均明显低于模型组(P均<0.05),丹参低、高剂量组间肺小动脉血管壁厚度系数和面积系数比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图1及表2。

图1 对照组和肺动脉高压各组大鼠肺组织病理形态学表现(HE染色)

表2 对照组和肺动脉高压各组大鼠肺小动脉血管壁厚度系数和面积系数比较

2.3各组大鼠血清SOD及ROS含量比较 与对照组比较,模型组血清 SOD含量明显降低(P<0.05),血清ROS含量明显升高(P<0.05);与模型组比较,丹参低、高剂量组血清SOD含量均明显升高(P均<0.05),血清ROS含量均明显降低(P均<0.05),丹参低、高剂量组间血清SOD及ROS含量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表3。

表3 对照组和肺动脉高压各组大鼠血清SOD、ROS含量比较

3 讨 论

肺动脉高压的发生发展涉及多种因素,如缺氧、炎症、氧化应激、内皮功能障碍［13-15］等。肺血管重构是肺动脉高压的基本病理特征,表现为血管平滑肌细胞增殖肥大、内皮细胞功能紊乱和细胞外基质沉积,而氧化应激参与了这种病理形态的改变。ROS是体内一类氧的电子还原产物,包括过氧阴离子(O2-)、过氧化氢(H2O2)等,主要由线粒体产生,生理状态下参与细胞内的应激反应,激活转录因子,调节细胞增殖和凋亡［16］。当多种因素导致肺动脉压力升高,血流动力学改变时,细胞内氧化还原稳态遭到破坏,ROS产生过多,过量累积的ROS会对细胞造成毒性伤害,引起脂质和蛋白质过氧化,导致细胞膜通透性增加,细胞内离子平衡紊乱,进而损伤细胞功能［17］。同时,ROS能引起NO生成减少,ET-1分泌增加,导致肺血管持续收缩,并激活核因子κB(NF-κB)及促细胞分裂原活化蛋白激酶(MAP kinase)家族,促进细胞增殖,导致肺血管平滑肌细胞肥大,发生肺血管重构［18-21］。而SOD作为氧自由基清道夫,能够催化O2-发生歧化反应,对抗和阻断O2-对细胞造成的损害,并及时修复受损细胞,恢复氧化/抗氧化系统平衡。

目前临床用于治疗肺动脉高压药物的作用途径包括前列环素途径、一氧化氮途径、内皮素-1(ET-1)途径,但费用昂贵,远期临床效果仍不乐观。相关研究证实,丹参可有效抑制多种肺动脉高压大鼠模型肺小血管的增生与重塑［22］;丹参及其化合物可以通过抑制蛋白激酶B(Akt)磷酸化、减少NF-κB和转录因子AP-1与DNA的结合、降低细胞内钙离子浓度以及增加电压门控性钾通道亚型Kv2.1、Kv1.5的表达等多种机制发挥作用［23-25］,但其具体机制仍需要进一步探究。

本实验结果显示,丹参干预后,肺动脉高压大鼠RVSP、mPAP、RVHI及血清ROS含量降低,血清SOD含量升高,肺小血管增生与重塑明显改善。提示丹参改善肺动脉高压的作用机制可能与减轻肺组织氧化应激损伤、调节氧化/抗氧化系统平衡有关,为深入探究丹参治疗肺动脉高压提供了新思路。

利益冲突:所有作者均声明不存在利益冲突。