生态修复河流微生物群落组成及影响因素研究

2023-07-29王革林于鲁冀王莉范鹏宇刘萌硕黎亚辉谷立坤

环境工程技术学报 2023年4期

王革林，于鲁冀，王莉，范鹏宇，刘萌硕，黎亚辉，谷立坤

1.郑州大学

2.河南工程学院

3.郑州大学综合设计研究院有限公司

城市河流中水体、沉积物的理化性质受人类排放废物的影响会发生较大变化。河流水体中的微生物与水环境存在较为复杂的相互作用，其生物总量与群落多样性的变化是水环境变化的一种反映[1-2]。沉积物是河流生态系统中重要的组成部分，也为水生生物的生存提供了栖息地[3-5]，微生物生存过程中可通过同化、异化作用去除沉积物中的污染物，同时还可通过对生境的重塑改变沉积物中营养盐及金属的结构和分布[6]。已有较多研究[7-11]表明，河流水质空间分布与周围环境状况密切相关，并造成河流中微生物群落结构的差异，如河流中氮素污染严重且碳氮比（C/N）较低的河段，起反硝化作用类的微生物丰度较低[12-14]；也有研究表明，沉积物中微生物群落只受到物理指标（pH、温度等）的影响[15-16]，袁瑞强等[17]得出引水更易导致河流沉积物中硫杆菌属（Thiobacillus）、芽孢杆菌（Bacillus）和乳球菌（Lactococcus）的变化，且引起这种变化的主要因素是有机质、总氮和总钾浓度。目前河流微生物研究较多集中于不同区域、不同水质及不同季节河流微生物群落组成和功能的分析，对河流生态修复工程中河流微生物的差异研究较少，笔者以具备生态修复工程措施的清潩河为例，研究微生物在生态修复工程措施中的群落组成差异及影响因素。

清潩河是淮河流域沙颍河水系的河流，地处河南省中部，干流全长149 km，流域总面积2 362 km2，流域几乎无天然径流汇入，其支流主要有西（东）小洪河、石梁河、新沟河、盛太河等。清潩河为许昌市的主要水体，担负着流域内长葛、许昌市城区大部分的纳污和防汛排涝任务，水体内污染物成分复杂，由于长期缺少天然径流汇入，自净能力不足，造成清潩河的水生态系统被破坏，治理难度较大。为了保障清潩河流域水系水质改善，常规的水质净化技术和生态修复技术难以满足要求，因此根据清潩河流域的特点，采取生态强化净化集成技术进行生态修复。

笔者对2021年夏季（6 月）清潩河上、下游关键采样点的水体（样品以W 标识）、沉积物（样品以S 标识）理化性质、微生物空间分布进行总结分析，并对微生物高通量测序进行检测，研究不同类型水体中微生物群落组成及不同生态修复措施下微生物的差异，以期为研判清潩河微生物生态修复工程对各种污染物的降解效果和开展保护清潩河流域水生态修复提供参考依据。

1 材料和方法

1.1 采样点情况及样品采集

根据清潩河生态修复工程措施的不同及周边环境状况和历年水质调查分析总结，在清潩河流域共选取17 个采样点，其中Q1 采样点处为增福庙水库，Q1～Q3 河段人为干扰较少，水体较为清洁；Q4 为自然河道与清潩河交汇口，主要接纳生活污水和农业废水，Q2、Q4、Q7、Q10 和Q15 采样点处建有生态滤坝，滤坝由格宾笼填卵石组成，依靠砾石上附着的微生物净化水质，滤坝还起着提高水位、减缓流速和增加汇水面积的作用，坝后跌水复氧，也能提高水体的自净能力。Q6 和Q8 采样点处有生态浮岛，浮岛由挺水植物搭配而成，挺水植物根区泌氧给微生物载体提供充足的挂膜条件，形成好氧区，有利于硝化作用的进行。Q11 采样点处设有生物飘带和“植物+微生物协调净化”修复工程，同时也是河岸带修复的起点，生物飘带利用基质挂膜能力强的作用，形成可观的微生物膜，净化水体中的NH4+-N 和TP，“植物+微生物协同净化技术”依靠植物根系的吸收、吸附作用，根系微生物分解作用和物种竞争相克作用，可有效削减水体中氮、磷污染物。Q12 为生态河床的起点，Q14 为生态河床终点，生态河床沿河道在河底铺设，采用格宾笼填卵石型，生态河床具有调节河道径流、蓄水量以及为水生生物提供栖息地的功能。Q16 为沉水植物恢复的起点，Q17 为沉水植物恢复的终点，沉水植物主要由金鱼藻、篦齿眼子菜、轮叶黑藻等组成，起着净化水质、抑制水体富营养化的作用。由于部分点位河段底部采用格宾笼铺设，未能采集到沉积物样本，因此本次沉积物样本仅有7 个。各采样点分布如图1 所示。

图1 采样点分布示意Fig.1 Distribution of sampling points

样品采集工作于清潩河平水期进行，大部分采样点河段水深不超过4 m，使用有机玻璃采水器采集水面下0.5～1 m 处水样于玻璃采样瓶内，带回实验室储存于4 ℃冰箱内，并在48 h 内完成理化指标的检测。使用铁锹或抓泥斗采集3 个不同位置的沉积物样品，混合后放入已灭菌的聚乙烯自封袋内，一部分储存于4 ℃冰箱内用于检测理化指标，另一部分置于-20 ℃冰箱内用于微生物检测分析。

1.2 分析检测方法

采集的水样在实验室过滤后采用《水和废水监测分析方法》测定其理化指标。溶解氧（DO）浓度和温度（T）在现场采用便携式水质监测仪（HACHDS5，美国）进行测定；采用pH 计（哈纳HI-8424，美国）测定pH 和电导率（ORP）。水样中总氮（TN）浓度采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定；总磷（TP）浓度采用过硫酸钾消解钼锑钪比色法测定；氨氮浓度（NH4+-N）采用纳氏试剂分光光度法测定；亚硝态氮（NO2--N）浓度采样N-乙二胺光度法测定；硝态氮（-N）浓度采用酚二磺酸法测定；化学需氧量（COD）用重铬酸钾法测定。沉积物中TN 浓度采用过硫酸钾消解法测定；TP 浓度在马弗炉中以450 ℃煅烧后，采用钼锑抗比色法测定；氨氮浓度经KCl 浸提后再以可见分光光度法测定；采用灼烧法测定有机质（OM）占比。

1.3 高通量测序分析

水体经过0.22 µm 滤膜抽滤后得到水体微生物样本，沉积物样本冷冻干燥后称取2.5 g 于5 mL 灭菌的离心管中。根据各类样本对应的DNA 提取试剂盒进行基因组DNA 抽提后，利用1% 琼脂糖凝胶电泳检测DNA 的完整性和纯度。PCR 扩增及产物电泳检测则以基因组DNA 为模板，根据测序区域的选择，使用带barcode 的引物及PremixTaq（TaKaRa）进行PCR 扩增。利用GeneToolsAnalysis-Software（Version 4.03.05.0，SynGene）对PCR 产物进行浓度对比后，按照等质量原则计算各样品所需体积，将各PCR 产物进行混合。使用E.Z.N.A.GelExtractionkit 凝胶回收试剂盒回收PCR 混合产物，用TE 缓冲液洗脱回收目标DNA 片段。后续按照NEBNext ULtraTM DNAlibrary PrepKitforIllumina 标准流程进行建库操作，完成后以高通量测序平台Hiseq 或Miseq 进行上机测序。

1.4 数据统计分析

使用R 软件绘制热图描述微生物群落物种组成和物种的丰度。基于bray-curtis 距离算法对beta 多样性进行层次聚类分析，以等级树的形式展示样本间的相似度。通过主坐标分析（principle coordinates analysis，PCoA）和非度量多维尺度分析（non-metric multidimensional scaling analysis，NMDS）探讨不同样本间的群落结构差异性并进行可视化。多组物种间的差异显著性采用单因素方差（one-way ANOVA）分析，其他检验方法采用SPSS 20 软件进行，并利用R 软件进行冗余分析（RDA）及可视化，其他统计分析和作图由Origin 2018 软件完成。

2 结果与讨论

2.1 水体和沉积物理化性质

由清潩河流域水体理化性质（表1）可见，Q1～Q3 段河流人为干扰较少，水环境质量较好，称该段为清洁段；Q4～Q12 段河流位于城区，且Q4 点位有自然河道汇入，造成该段河流水体中COD、NH4+-N 和TN 浓度显著升高；Q13～Q17 段河流位于城郊，人为排放的废水较少，在水体自净能力作用下水质又逐渐得到改善。整体而言，清潩河各采样点TN 浓度为3.07～11.54 mg/L，平均值为8.61 mg/L，整体处于劣Ⅴ类水质；TP 浓度为0.005 ～0.230 mg/L，平均值为0.046 mg/L，保持在Ⅰ～Ⅱ类水质；COD 在城区段最高值达到61.12 mg/L（劣Ⅴ类）。目前清潩河仍需关注COD 和TN 的治理。

表1 清潩河流域水体理化指标Table 1 Physical and chemical indexes of water bodies in Qingyi River basin

清潩河各采样点沉积物理化指标变化如图2 所示。沉积物中TN 和TP 浓度整体较高。沉积物中OM 占比为3.3%～10.1%，其中Q6～Q11 河段受城区人类活动影响OM 占比较高；Q8 采样点受周围居民区生活污水的影响，OM 占比最高。Q6 采样点处为硬质化河段，水体流速缓慢且浑浊，水体中硝化作用受阻，造成该点位沉积物中NH4+-N 浓度较高（29.32 mg/kg）。受周边环境和人类生活的影响，沉积物中TN、TP 浓度变化几乎一致，其中流经市区段（Q6～Q11）时TN 和TP 浓度较高，经过水体的自净作用下游采样点沉积物中TN 和TP 浓度显著降低。

图2 清潩河沉积物理化指标Fig.2 Physical and chemical properties of sediments in the Qingyi River

2.2 微生物群落组成

在清潩河水体中，变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、疣微菌门（Verrucomicrobia ）、厚壁菌门（Firmicutes）、绿弯菌门（Chloroflexi）、酸杆菌门（Acidobacteria）等25 个优势菌门的菌群数占总菌群数的97.5%以上。多项研究表明，变形菌门、拟杆菌门和酸杆菌门是河流水生态系统中的优势微生物，它们是厌氧氨氧化、硫酸盐还原等生物地球化学过程的重要贡献者，该类菌门在水体中相对丰度表现为城郊段＞清洁段，在沉积物中相对丰度表现为城郊段＞城区段，说明城郊段是脱氮和硫还原的主要场所。绿弯菌门和酸杆菌门是已知指示污染物的微生物，其在城郊段Q14 点位水体中的相对丰度最高，分别达到1.5% 和0.9%，而在沉积物中相对丰度表现为城区段＞城郊段，说明城区段污染最为严重。

在属水平上对清潩河水体和沉积物中的微生物进行分析，结果如图3 所示。由图3（a）可知，清潩河水体中不动杆菌属（Acinetobacter）、hgcl_clade、Candidatus_Aquiluna、Limnohabitans和Polynucleobacter等属类微生物占总体属水平微生物的0.6%。不动杆菌属是污水细菌群落的核心类群，有指示水体污染的作用，其在Q14 点位水体中相对丰度高达0.61%，表明城区段水体污染物浓度较高。另外，hgcl_clade 和CL500-29_marine_group 与蓝藻密切相关，在增福庙水库Q1 点位水体中相对丰度分别达到了0.19% 和0.02%，说明水库水体存在蓝藻异常增殖的风险。此外，Limnohabitans属细菌在富营养化水体和磷循环中起重要作用，在城郊段各点位相对丰度皆达到0.04%以上，说明城郊段是磷循环的主要场所。清潩河沉积物中微生物多样性指数较大，但各物种相对丰度较低，如图3（b）所示，通过对前23 的优势物种进行分析发现，丰度较高的Smithella、硫杆菌属（Thiobacillus）、RBG-16-49-21、厌氧绳菌属（Anaerolinea）和Leptolinea，相对丰度仅为0.08%。硫杆菌属具有反硝化作用，其相对丰度在上下游分别为0.01% 和0.11%，表明下游反硝化能力比上游更强。

图3 水体和沉积物属水平群落组成分析Fig.3 Analysis of genus level community composition in water and sediment

2.3 水体和沉积物中微生物多样性与差异性

2.3.1 细菌群落丰富度和多样性

对清潩河清洁段、城区段和城郊段微生物多样性指数进行研究及OUT 聚类分析，结果显示，清潩河水体和沉积物中OTU 数目分别为2 626 和8 619 个，Coverage 指数均高于0.99，说明清潩河水质状况由差转好的过程可以通过微生物多样性指数的变化来反映[18]。根据表2 可知，Q16 采样点的Chao 指数最高（2 530.4），Shannon-Wninner 指数较低（5.13），表明该采样点微生物多样性较低，但丰富度较高；相比之下，Q2 采样点的Shannon-Wninner 指数最高（6.99），Chao 指数较低（1 386.8），说明该采样点物种多样性较高，但丰富度较低。Pearson 相关分析显示，Shannon-Wninner 指数与pH 呈显著正相关（R=0.915，P＜0.05），与总溶解性固体物质（TDS）（R=-0.970，P＜0.01）、-N（R=-0.936，P＜0.01）呈极显著负相关，而Chao 指数与Shannon-Wninner 多样性指数呈显著正相关（R=0.738，P＜0.05）。

表2 水体和沉积物样品在97%水平下的丰富度和多样性指数Table 2 Richness and diversity index of water and sediment samples at 97% level

沉积物中微生物的丰度和多样性在Q6 采样点处最低，而在Q10～Q12 的城区段较高，表明微生物受到人类生活的影响较大。Q17 采样点的微生物丰度较高，但多样性有所下降，这可能是由于对污染物有降解作用的微生物大量繁殖，阻碍了其他细菌的生长，从而导致微生物多样性的降低。Pearson 相关分析表明，沉积物中Chao 指数与OM 占比和NH4+-N 浓度呈显著负相关，与Shannon-Wninner 指数呈正相关。说明水体污染物浓度的增加造成沉积物中微生物多样性下降。

2.3.2 细菌群落差异性分析

基于属水平的河流12 个采样点PCoA 分析〔图4（a）〕结果表明，不同采样点之间存在明显差异，2 个主要成分被提取，解释了62.8%的微生物组成变化，其中PCoA1 轴能解释50.5%的微生物群落组成差异，PCoA2 轴解释了12.3%的微生物群落组成差异。在主坐标轴PCoA1 上，水体样品和沉积物样品明显分开，说明水体和沉积物微生物群落存在明显差异；在副坐标轴PCoA2 上，水体清洁段点位与城郊段点位也有分开，说明清洁段与城郊段水体微生物存在差异性；城区段沉积物点位较为分散，可能是由于城区段河流受人类活动影响，水环境状况不同，水体主要功能菌群发生了变化，进而造成了微生物群落特异性差异。

图4 水体和沉积物的 PCoA 及细菌群落结构聚类分析Fig.4 Cluster analysis of PCoA and bacterial community structure in water and sediment

层次聚类是常用的beta 多样性分析手段。Bray-Curtis 相似度结果〔图4（b）〕显示，水体和沉积物样品各自聚类；清洁段水体Q1-W、Q2-W、Q16-W 归为一类，其中hgcl_clade 和不动杆菌属的相对丰度较高；城郊段Q14-W、Q17-W 聚类，不动杆菌属相对丰度最高；沉积物城区段Q6-S、Q10-S 归为一类，其中Smithella菌属的相对丰度较高（分别为0.06%和0.04%），城区段Q7-S、Q11-S、Q12-S 和城郊段Q14-S、Q17-S 聚类，优势菌类的相对丰度较为均匀，结合2.1 节沉积物理化性质，分析其原因可能是沉积物中污染物浓度较高，为功能菌繁殖提供了良好的条件。

2.4 微生物群落结构与环境因子关系

以清潩河微生物群落结构与环境因子的响应关系为研究对象，选取清潩河微生物属水平前15 的优势物种，利用Spearman 相关系数计算环境因子与物种丰富度之间的相关性，揭示微生物与环境因子的关联性，并以热图的形式展示出其显著性（P），结果如图5 所示。

图5 清潩河微生物群落结构与环境因子相关性分析Fig.5 Correlation analysis of microbial community structure and environmental factors in the Qingyi River

由图5（a）可见，在属水平上，水体中的鞘氨醇单胞菌（Sphingorhabdus）与TN 和-N 呈显著负相关，与NO2--N 呈极显著负相关，说明该物种在清潩河中受氮素影响较大，且对NO2--N 浓度极为敏感，可将该物种作为判断清潩河氮素污染情况的指示物种。由图3（a）可知，城区段鞘氨醇单胞菌相对丰度显著低于城郊段和清洁段，说明城区段河流氮素污染较为严重。NH4+-N 与念珠菌（Candidatus_Aquiluna）、hgcl_clade 和氧化硫柠檬酸杆菌（Limnobacter）呈显著负相关，而DO 与hgcl_clade和氧化硫柠檬酸杆菌呈显著正相关；TP 与不动杆菌属（Acinetobacter）呈极显著正相关；ORP 与多核杆菌属（Polynucleobacter）和嗜冷菌属（Algoriphagus）呈显著正相关。由左侧聚类树可知，鞘氨醇单胞菌和念珠藻、hgcl_clade 和氧化硫柠檬酸杆菌、假单胞菌（Pseudomonas）和Limnohabitans、多核杆菌属和Algoriphagus对水体环境T、pH、DO、ORP、TDS、EC 和COD 等指标的响应程度几乎相同，说明该类生物的生存条件相近。由图5（b）可知，清潩河沉积物中TN 和NH4+-N 与硫杆菌呈显著负相关，而OM 和TP 对微生物群落结构影响不大。

2.5 清潩河微生物群落主要功能类群

2.5.1 清潩河沉积物中微生物主要功能类群

研究清潩河沉积物中对碳氮硫起循环作用的微生物（硝化菌、反硝化菌、硫酸盐还原菌和甲烷氧化菌）空间分布特征，结果如图6 所示。清潩河下游沉积物中硝化菌和硫酸盐还原菌的相对丰度高于上游，说明下游氮硝化和硫还原能力强于上游，与2.2 节结论一致。其中硝化螺旋菌纲（Nitrospira,0.002%）是起硝化作用的主要功能菌，亚硝化菌科（Nitrosomonadaceae）是主要的亚硝化功能菌；脱硫菌科在硫还原菌中相对丰度最高，脱硫菌科是主要的硫循环菌，其下游相对丰度（0.006%）是上游循环菌（0.003%）的2 倍，其次是脱硫盒菌科（Desulfarculaceae,0.001%），在整个清潩河流域均有一定的丰度，且脱硫线菌属（Desulfonema）、脱硫球菌属（Desulfococcus、Desulfobacterium）、脱硫叶菌属（Desulfobulbus）、脱硫单胞菌属（Desulfuromonas）、和脱硫弧菌属（Desulfovibrio）皆是下游相对丰度高于上游，可见下游是硫循环的主要场所。

图6 沉积物微生物群落主要功能类群Fig.6 Main functional groups of sediment microbial communities

反硝化细菌和甲烷氧化菌在清潩河上游沉积物中的相对丰度高于下游。在整个清潩河流域硫杆菌（Thiobacillus）是主要的反硝化菌，尤其在Q10 采样点，硫杆菌相对丰度（0.05%）远远高于其他采样点；甲基球菌属（Methylococcaceae）和甲基单胞菌属（Methylomonas）是清潩河主要的甲烷氧化菌，其相对丰度分别为0.10%和0.03%。

2.5.2 清潩河水体和沉积物中致病菌群分析

依据对清潩河水体和沉积物中的微生物群落调查，筛选出对人类具有致病作用的几种优势菌群进行分析。由图7（a）可知，不动杆菌属为第一优势物种，在Q14 采样点相对丰度达到0.61%，可能是该采样点地势低且建筑较多造成的潮湿环境提供了良好的生存环境。沉积物〔图7（b）〕中丰度较高的致病菌为梭状芽孢杆菌属（Clostridium）和黄杆菌属（Flavobacterium）。梭状芽孢杆菌属主要存在于腐败物种中，Q10 采样点梭状芽孢杆菌属相对丰度最高（0.02%），可能是该采样点较高的COD 促进了梭状芽孢杆菌属的生长；黄杆菌属广泛存在于淡水体系中，在Q6（0.02%）和Q10（0.02%）采样点相对丰度较高，该菌具有感染性，可导致免疫能力下降。总体而言，河流致病风险呈现出城区段＞城郊段＞清洁段。

图7 清潩河水体和沉积物致病菌群丰度Fig.7 Abundance of pathogenic bacterial communities in water bodies and sediments of the Qingyi River

3 讨论

清潩河上游承接五虎赵水库、唐寨水库和增福庙水库，水质较好，整体达到地表水Ⅱ类标准。清潩河清洁段（Q1～Q3）河道设有近自然河岸带，并在Q2 点位设有生态滤坝，该河段水体受到人类干扰活动的影响较小，除TN 和TP 浓度有些许增加外，其他指标几乎没有变化。当清潩河进入城区段（Q4 ～Q12）时，受人类活动的影响，水体COD、TDS、TN 和TP 的浓度急剧升高，其中Q7 和Q10 采样点受周围医药企业、重金属行业制造厂和污水处理厂废水的影响，水质尤其差；而在城郊段（Q13～Q17），水体中污染物浓度显著下降，这表明关庄闸生态浮岛及生态滤坝等设施在水质净化方面发挥了一定的作用。沉积物污染物浓度的变化趋势与水体基本一致，在城区段OM 占比、TP、TN 和NH4+-N 浓度显著增加，表明城区生活污水的排放对河流水质产生了很大的影响，并在水-沉积物界面吸附沉降。

清潩河微生物多样性在空间上分布具有差异性，有研究表明微生物多样性受COD、pH 和温度的影响[19-20]，与本文结论一致。Q1 采样点水质较好，微生物多样性和丰度较为均匀。Q2～Q3 点位受周边农田影响，微生物多样性急剧升高；近自然河岸带和生态滤坝等设施对陆源污染物的截留，使得该段水质变化不大，微生物丰度无明显上升。Q11 和Q12点位受上游污水处理厂尾水的汇入和生态滤坝的拦截效果，沉积物中微生物的多样性和丰度均高于其他采样点。Q15 点位多样性有所下降，但物种丰富度仍然较高，说明该段特殊菌群的富集可能限制了其他物种的生长。

大量文献表明，变形菌门、拟杆菌门和放线菌门是常见的淡水菌门[21]。变形菌门和放线菌门在河流中有机物降解方面起着重要作用，上游水体中变形菌门的相对丰度高于下游，而下游放线菌门的相对丰度比上游高，这可能是由于有机物浓度低的水体中变形菌门的降解作用大于放线菌门，而有机物浓度高的水体更适合放线菌门降解有机物，在沉积物中也可得出相同的结论。拟杆菌门下黄杆菌属能降解藻类有机物或生物聚合物，伯克氏菌科下的unclasified_f_Burkholderiaceae和Limnohabitams菌属能降解有机农药和多氯联苯，该类菌属在城郊段丰度高于城区段；新鞘脂菌属可降解有机物和多环芳烃，在城区Q5～Q6 段菌群丰度较高；蓝藻门是一类能通过产氧光合作用获取能量的细菌，在清洁段相对丰度高于城区段，说明功能菌群分布受人类活动对水质干扰的影响。绿弯菌门是一种光合作用产生能量的细菌[22]，属于兼性厌氧菌，不产生氧气且不固氮[23]，清潩河城区段氮浓度高于城郊段，可能与绿弯菌门丰度的变化有关。硝酸盐在地表水中可以被硫杆菌通过反硝化作用去除，而在硝态氮高的采样点沉积物中也检测到了硫杆菌，这可能是因为清潩河水体流速较慢，为沉积物中的硫杆菌提供了缺氧环境，有利于反硝化反应的进行。

清潩河水体微生物群落结构受DO、pH、NH4+-N、TN 和TP 等环境指标的影响。黄杆菌属是淡水中常见的反硝化功能菌，对pH 较为敏感[24]，城区段的pH 较高，促进了黄杆菌属的活性，增加了其丰度。异养菌属（Limnobacter）、氨氧化古菌（Candidatus_Aquiluna）与DO、NH4+-N 呈正相关，表明它们对河流中NH4+-N、OM 变化具有较好的适应性。黄海鞘氨醇杆状菌（Sphingorhabdus）、噬氢菌属与TN、NH4+-N 和TP 呈正相关，汇入的污水会导致NH4+-N、TN和TP 浓度升高，从而增加黄海鞘氨醇杆状菌和噬氢菌属的丰度。