基于沉积物eDNA评估三疣梭子蟹资源量的方法初探

张凡瑶, 张再美, 陈萌琦, 韦东升, 徐严欢, 姚 冰, 孙振宁, 李 慧, 杨艳艳, 周 兴, 李 凡, 陈翠霞

基于沉积物eDNA评估三疣梭子蟹资源量的方法初探

张凡瑶1, 张再美1, 陈萌琦1, 韦东升1, 徐严欢1, 姚 冰1, 孙振宁2, 李 慧1, 杨艳艳2, 周 兴3, 李 凡2, 陈翠霞1

(1. 中国石油大学(华东)化学化工学院, 山东 青岛 266580; 2. 山东省海洋资源与环境研究院, 山东省海洋生态修复重点实验室, 山东 烟台 264006; 3. 山东省青岛市黄岛区海洋发展局, 山东 青岛 266499)

本文旨在通过沉积物eDNA(environmental DNA)的分析, 建立一种快速评估三疣梭子蟹资源量的方法。采用柱状采泥器对莱州湾同一地点(37°30″E、119°20″N)不同深度(0~24 cm, 7个深度)进行样品采集, 提取不同深度地层沉积物中的eDNA, 并以此为模板, 运用三疣梭子蟹COI基因通用型引物和特异性引物分别进行普通PCR和实时荧光定量PCR (quantitative PCR, qPCR)扩增, 评估莱州湾近年来三疣梭子蟹的资源量变化。结果显示: 7个样品的eDNA中均能扩增出700 bp长度的DNA产物, 表明在不同深度沉积物所代表的年份均有三疣梭子蟹的存在; 通过Clustal X与MEGA 7.0软件比对各序列碱基之间的差异性, 发现不同柱深沉积物中的COI基因共出现11个变化位点, 包括8个转换位点、2个颠换位点和1个插入位点; qPCR结果显示, 8~9 cm处的三疣梭子蟹COI基因拷贝数要大于其他深度地层沉积物, 说明此柱深代表的年份中三疣梭子蟹的资源量高于其他年份。利用沉积物eDNA评估莱州湾海域内的三疣梭子蟹资源量的方法, 可以打破时间和空间的限制, 检测不同年份三疣梭子蟹的资源量的变化。

eDNA; 三疣梭子蟹; COI基因; qPCR; 资源量

三疣梭子蟹()俗称海蟹或大蟹, 属于甲壳纲十足目梭子蟹科, 在我国大陆架海域广为分布, 具有体型较大、肉质肥美、营养丰富等优点, 是我国单物种产量最高的一种蟹类, 同时也是山东近海主要的增殖放流物种之一[1-2]。但是, 由于过度捕捞和环境变化的双重影响, 其资源量不断衰退[3]。因此, 自2007年起, 山东省开始在莱州湾大规模放流三疣梭子蟹[4], 截至2020年, 已累计放流三疣梭子蟹稚蟹超过10亿尾。为合理确定放流数量和地点、提高放流效率、科学评价放流效果, 急需一种科学、准确、便捷的三疣梭子蟹资源量评估技术。

近年来, 不少学者对三疣梭子蟹的资源量进行研究, 杨刚等[5]、张明亮等[6]构建ECOPATH模型, 将生态系统简化为不同功能组, 利用各功能组的能量输入与输出的关系, 估算三疣梭子蟹在莱州湾的生态容量为3 749 t。王彬等[7]、Sun等[8]、吴强等[9]利用扫海面积法, 即根据拖网单位时间的扫海面积和拖网渔获量估算单位面积内三疣梭子蟹的绝对数量。高丽等[10]利用Ricker亲体-补充量关系模型即群体资源量与补充量之间的关系对浙江渔场内三疣梭子蟹进行动态变化的预测。上述研究为三疣梭子蟹在特定地点的资源量估算提供了科学的方法, 然而扫海面积法存在资金投入大、取样时间受限制等局限性, 难以高效准确地掌握三疣梭子蟹的资源量及其时间序列信息; 由于种群数量较大且呈现动态变化, 使得ECOPATH模型与Ricker亲体-补充量关系模型法对于物种资源量的评估仍存在投入资金大、非标准取样、对物种数量有破坏性等方面的局限性。

eDNA是20世纪90年代发展起来的一项技术, 是指从水、沉积物等环境样本中提取到的DNA, 包括细胞内DNA和细胞外DNA, 可用于监测水生生物物种丰富度[11]。Ficetola等[12]利用eDNA信息分析成功检测到入侵物种牛蛙的存在, 被认为是eDNA首次用于水生生物监测。随后, eDNA被用来检测海洋脊椎动物和海洋无脊椎动物等[13], 实现了对水生生物种类的评估。自2010年以来, 随着qPCR和DNA条形码技术的发展, eDNA技术逐渐从定性分析物种存在与否逐渐扩展到定量分析物种的丰度[14-17]。海洋沉积物是许多生物的归宿, 记录着海洋环境长期演变信息[18], 而沉积柱样品作为胞外DNA的载体[19], 保留了多种物种的混合复杂基因组信息, 相较于其他海洋环境样品, 基因组信息丰富, 故海洋沉积物是研究海洋生物的重要物质[20]。评估同一地点不同深度沉积物中生物的DNA的含量, 有助于重建某段时间内、某一海域某一物种的种群数量信息[21], 尤其利于某一物种的历史变动分析[22]。

与传统的生物监测手段不同, eDNA无需对物种本身而只要对环境样本进行操作处理, 具有资金投入少、取样简单、灵敏度高等优势, 逐渐被应用于生物物种监测、生物量估算等方面[23]。本文通过对莱州湾同一地点不同深度地层沉积物进行eDNA提取, 并利用qPCR的方法, 初步建立一种基于沉积物eDNA评估三疣梭子蟹资源量的方法。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 三疣梭子蟹

本实验所用的三疣梭子蟹由青岛慧鹏海水养殖公司(青岛海清)提供, 大小为0.3 kg/只, 从养殖场取回后, 保存于−80℃冰箱里备用。

1.1.2 沉积物样品

沉积物样品来自莱州湾(37°30″E、119°20″N)柱状采泥器采集的样品, 样品运送过程中, 用生物冰块保存, 收到样品后, 保存于−80℃冰箱里备用。实验中采用的柱深分别为0~1 cm, 7~8 cm, 8~9 cm, 9~10 cm, 10~11 cm, 13~14 cm, 22~24 cm。每一深度沉积物在进行eDNA提取时, 取5个重复样品。设置连续柱深和非连续柱深的目的是为验证不同地层深度eDNA含量的差异性。

1.2 实验方法

1.2.1 蟹肌肉组织DNA和环境DNA提取与检测

取0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm(约0.5 g)大小的三疣梭子蟹肌肉组织样品, 剪碎, 加入550 μL DNA裂解液(0.5 mol/L Tris-HCl, 0.1 mol/L EDTA, 5 mol/L NaCl, 10% SDS, 1 g RNA酶), 混匀后, 加入20 μL蛋白酶K, 置于56℃水浴锅中水浴消化2~3 h至溶液透明, 采用苯酚-氯仿提取法提取三疣梭子蟹基因组DNA。分别取0.5 g不同地层深度的沉积物样品(5个重复样品), 采用Fast DNA Spin Kit for Soil试剂盒提取沉积物样品DNA, 并溶于60 μL的缓冲液中。用NANODrop 2000超微量分光光度计检测三疣梭子蟹肌肉组织DNA和沉积物样品DNA浓度, −20℃保存备用。

1.2.2 普通PCR与qPCR扩增

PCR扩增引物: 采用COI基因普通PCR引物序列(COIL1490, COIH2198)[24-25]扩增三疣梭子蟹COI基因, 以进行序列一致性分析, 利用Primer 5.0设计三疣梭子蟹特异性qPCR引物COI-qPCR for和COI-qPCR rev用于COI基因的定量分析, 用Primer 5.0设计引物COI-NE for 和COI-NE rev, 扩增特定COI基因片段, 作为模板建立qPCR标准曲线(表1), 各引物由生工生物工程(上海)有限公司合成。

表1 PCR扩增引物及产物

PCR扩增体系及反应条件: PCR扩增体系为25 μL, 反应液包括12.5 μL 2×GC buffer I, 4 μL dNTP Mixture (2.5 mmol/L), 0.25 μL TaKaRa LA Taq (5 U/μL), 1 μL模板DNA, 引物各1 μL(10 mmol/L), 无菌去离子水补齐至25 μL。PCR扩增程序为: (1)95℃ 5 min; (2)95℃ 50 s, 52℃ 45 s, 72℃ 1 min, 35个循环; (3)72℃ 10 min。

qPCR扩增体系及反应条件: 使用宝日医生物技术(北京)有限公司的TB Green Premix Ex TaqTMII (Tli RNaseH Plus) qPCR试剂盒进行qPCR扩增。为建立标准曲线, 以COI-NE for和COI-NE rev为引物, 以三疣梭子蟹肌肉组织DNA为模板进行PCR扩增, 得到COI特定基因片段, 纯化回收后作为模板用于qPCR扩增。将模板DNA以5倍浓度进行梯度稀释, 进行qPCR。qPCR扩增体系为20 μL反应体系, 反应液包括SYBR®Premix ExTaq™ 10 μL, 0.4 μL上、下游引物(10 μmol/L), 模板 2 μL, ROXII 0.4 μL, 水6.8 μL。扩增反应程序为3步法: 95℃预变性30 s; 95℃变性5 s, 57℃退火30 s, 72℃延伸32 s, 40个循环。沉积物eDNA模板不经稀释, 取2 μL作为模板, 采用相同的条件进行扩增。沉积物DNA与标准品DNA均做3个重复。

PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测, 将大小正确的条带纯化回收后送生工生物工程(上海)有限公司测序。

1.2.3 COI基因序列比对

将测序所得到的8条序列(三疣梭子蟹肌肉组织DNA和7个沉积物eDNA)分别在NCBI Gene Bank比对, 确定所扩增序列是否为三疣梭子蟹COI基因。利用Clustal X与MEGA 7.0软件比对各序列碱基之间的差异性。

1.2.4 qPCR分析

首先, 采用ABI 7500 Software自动计算各样品的t值(t值为每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数), 同时, 根据作为标准曲线模板的COI基因(1348 bp)的DNA浓度, 利用下列公式计算模板COI基因的拷贝数, 以平均t值为横坐标, 以lg(已知COI基因拷贝数)为纵坐标, 绘制标准曲线。将沉积物平均t值代入标准曲线, 计算得到沉积物中COI基因的拷贝数。

2 结果与分析

2.1 三疣梭子蟹基因组DNA及沉积物eDNA COI基因扩增

通过NANODrop2000超微量分光光度计检测, 三疣梭子蟹及沉积物样品中DNA的质量浓度分别为8 376、446.4、336、174、156、267.6、57.6、92.4 ng/g, 以三疣梭子蟹和不同地层沉积物eDNA为模板, 采用通用型COI基因引物(COIL1490, COIH2198)扩增COI基因, 并对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳验证。结果显示, 凝胶电泳条带明亮清晰且均可扩增得到长度在700 bp左右的目的条带(图1), 证明各DNA均可成功扩增得到COI基因, 并且特异性良好。

2.2 不同柱深沉积物三疣梭子蟹COI基因序列比对

利用1.2.3方法对所测得的序列(647 bp)进行分析。序列碱基组成分析发现, 各样品扩增的COI基因的A+T的平均含量为62.27%, G+C的平均含量37.73%。序列碱基突变位点分析结果显示通过通用引物扩增得到的COI基因有11个突变位点(表2), 包括8个转换位点、2个颠换位点和1个插入位点。与NCBI数据库中的三疣梭子蟹COI基因序列相比[26], 养殖的三疣梭子蟹COI基因在574位插入T并在594位出现G-C颠换。其余地层深度所提取的eDNA扩增的COI基因序列在134位均出现A-G转换, 10~11 cm所提取的eDNA扩增的COI基因序列在276位出现了G-C颠换。总体分析结果说明7个沉积物中所提取到的eDNA扩增得到的COI基因与2020年新上传的三疣梭子蟹COI基因序列相似度达到99%以上[26], 表明不同沉积物中三疣梭子蟹未发生明显的遗传变异。

图1 COI基因PCR产物凝胶电泳图

注: M表示D2000 plus DNA Ladder; 1表示三疣梭子蟹肌肉组织DNA; 2—8分别表示不同地层沉积物DNA(对应地层分别为0~1 cm; 7~8 cm; 8~9 cm; 9~10 cm; 10~11 cm; 13~14 cm; 22~24 cm)

表2 不同地层沉积物中eDNA扩增的COI基因片段遗传一致性分析

注: “-”表示无碱基变化, 括号内为变化位点

2.3 qPCR定量分析

2.3.1 标准曲线

以三疣梭子蟹肌肉基因组DNA为模板, COI- NE for和COI-NE rev为引物, 进行PCR扩增, 获得1 348 bp大小的COI基因片段, 将基因片段进行纯化回收, 利用NANODrop 2000超微量分光光度计测定模板质量浓度为20.8 ng/μL。将该溶液梯度稀释后作为模板, 并按照1.2.4公式计算COI基因的拷贝数。随后, 采用COI-qPCR引物对, 进行qPCR。扩增结果如图2所示, 在指数扩增区域每条扩增曲线之间均被隔开, 且每个反应的熔解曲线在80~80.5℃处均出现单峰, 表明设计的qPCR引物特异性强, 扩增效果好。

依据qPCR的结果, 三疣梭子蟹COI基因的标准曲线如图3所示, 该曲线拟合方程为=10.183−0.265 5,2=0.992 3, 表明t值与COI基因拷贝数的对数之间呈现良好的线性关系, 该基因可用来测定环境中三疣梭子蟹基因组DNA含量。

图2 COI基因扩增曲线和基因溶解曲线

图3 COI基因拷贝数标准曲线

2.3.2 三疣梭子蟹基因拷贝数分析

按照1.2.4所示方法, 以不同柱深沉积物eDNA为模板, 进行qPCR, 得到不同柱深沉积物中eDNA模板扩增的t值, 利用标准曲线, 获得不同沉积物中三疣梭子蟹COI基因的拷贝数, 进而获得每克沉积物中COI基因的拷贝数(图4)。结果显示, 0~1 cm、7~8 cm、9~10 cm、10~11 cm、22~24 cm这5个深度的COI基因拷贝数大致相同, 8~9 cm的柱状沉积物中COI基因的拷贝数最高, 而13~14 cm的柱状沉积物中COI基因的拷贝数最低。

图4 地层深度与COI基因拷贝数的关系

3 讨论

eDNA是生物体释放到环境中的DNA, 其浓度与生物量有关, 且不受温度的影响[27]。研究发现表层沉积物中eDNA相对比较稳定, 一旦进入水体后会被快速降解[28-29]。因此可通过不同地层eDNA的丰度及特定物种DNA探针检测不同生物在特定时期内的资源量, 然而, 沉积物eDNA的提取效率一直是困扰科研人员的一个问题。目前, 沉积物中eDNA的提取有SDS提取法、高盐法、蛋白酶K法、试剂盒法等, 大致可以分为两类, 即直接提取法和间接提取法[30]。本研究前期利用直接法提取不同地层深度沉积物中的eDNA, 获得的eDNA含量低, 凝胶电泳结果显示PCR扩增后无条带或条带较暗且有杂带和拖带, 说明提取的eDNA质量较差, 可能与沉积物中所含的腐殖质酸、eDNA提取试剂酚类化合物等抑制了PCR过程有关[31]。而试剂盒法能较好地解决该问题, 本研究采用MP BIO公司开发的Fast DNA Spin Kit for Soil试剂盒[32]对沉积物进行eDNA快速提取, 在较短时间内有效提取eDNA且避免PCR抑制剂等的干扰, 凝胶电泳结果显示PCR扩增后条带清晰且明亮。同时, 为提高eDNA提取的重复性, 在提取eDNA样品时, 采用同一平面九点取样法, 大大提高了各样品eDNA提取的效率和准确率。在以后的研究中, 如何保证提取各沉积物eDNA浓度的重复性, 仍是需要研究的重点。

在获取高质量的eDNA后, 本研究以其为模板, 采用三疣梭子蟹特异性COI基因的引物COI-qPCR for和COI-qPCR rev进行PCR扩增, 结合荧光定量PCR技术, 可预估不同地层深度沉积物中三疣梭子蟹COI基因的拷贝数。参考海洋沉积物同位素年代测定结果[33-34], 预估本实验7~8 cm沉积物对应年代约为2013年。从DNA拷贝数与不同地层深度的关系可知, 相较于其他地层, 8~9 cm所对应的2012年左右所对应的DNA拷贝数较多, 13~14 cm所处的2007年左右所对应的DNA拷贝数较少, 其余地层深度所对应年代的DNA拷贝数大致相同, 说明自实施渔业修复计划以来三疣梭子蟹产量有所增加, 但0~1 cm所处的地层含有的DNA拷贝数较少, 间接说明三疣梭子蟹含量可能在降低。这一发现, 能够有效地监测三疣梭子蟹在不同地层年代的资源量, 科学评价三疣梭子蟹自然资源量的变化并依此制定相应的政策。

综上所述, 本研究成功从不同地层沉积物中提取到包含三疣梭子蟹基因在内的eDNA, 利用qPCR技术检测沉积物eDNA中的三疣梭子蟹COI基因拷贝数, 可用于评估三疣梭子蟹的资源量。eDNA是含有大量细胞的有机体经过时间的推移后在环境中留下的残骸, 是目前检测生态物种资源量最简单高效的手段, 但eDNA技术的局限性如样品污染、DNA的降解、PCR抑制剂以及数据库不完整等技术性问题, 如何通过实验技术优化, 提升eDNA技术在评估特定物种资源量方面的精确度, 仍是需努力解决的问题。

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Huang Xueyong. Analysis of sedimentary characteristics in the Guangli River estuary and the Western Laizhou Bay[D]. Dalian: Liaoning Normal University, 2019.

A preliminary method to assess theresource based on sedimentary eDNA

ZHANG Fan-yao1, ZHANG Zai-mei1, CHEN Meng-qi1, WEI Dong-sheng1, XU Yan-huan1, YAO Bing1, SUN Zhen-ning2, LI Hui1, YANG Yan-yan2, ZHOU Xing3, LI Fan2, CHEN Cui-xia1

(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, China University of Petroleum, Qingdao 266580, China; 2. The Key Laboratory of Restoration for Marine Ecology of Shandong Province, Shandong Marine Resources and Environment Research Institute, Yantai 264006, China; 3. Qingdao Municipal Marine Development Bureau, Qingdao 266499, China)

This study aimed to establish a rapid method to assess theresource by analyzing sedimentary environmental DNA (eDNA). Samples were collected at different sediment depths (0~24 cm, 7 depths) from the same location (37°30″ E, 119°20″ N) in Laizhou Bay using a column mud collector. The eDNA samples extracted from the ocean sediments served as the template to amplify the cytochromeoxidase subunit 1 (COI) gene by polymerase chain reaction (PCR) and quantitative PCR (qPCR) using universal and specific primers for theCOI geneThe amplified products were used to assess theresource in Laizhou Bay. The results showed that the 700 bp COI gene fragments were amplified from all extracted eDNA, indicating the presence ofin the years represented by the sediments at different depths. Genetic consistency was analyzed by Clustal X and MEGA 7.0 software, and 11 variable sites, including 8 conversion sites, 2 inversion sites, and 1 insertion site, were found for the COI gene at the different depths, suggesting high homology ofin the years represented by the 7 sediments. The qPCR results showed that theCOI gene copy number at 8–9 cm of soil depth was higher than that at the other depths, suggesting that theresource was richer in the years represented by the 8~9 cm depth than the other years. Using sedimentary eDNA saved time and space when assessing theresource in Laizhou Bay.

eDNA; Portunus trituberculatus; COI gene; qPCR; resource

May 20, 2022

S932.5＋2

A

1000-3096(2023)5-0113-08

10.11759/hykx20220520001

2022-05-20;

2022-07-27

烟台市科技创新发展计划(2020MSGY056); 山东省自然科学基金重点项目(ZR2020KE050); 烟台市科技创新发展计划(2021XDHZ053); 山东省教学改革重点项目(Z2022114)

[The Science and Technology Innovation Development Program of Yantai, No. 2020MSGY056; Key Project of Natural Science Foundation of Shandong Province, No. ZR2020KE050; Science and Technology Innovative Development Programme of Yantai, No. 2021XDHZ053; Shandong Province Teaching Reform Key Project, No. Z2022114]

张凡瑶(1997—), 女, 山东日照人, 硕士生, 攻读专业为生物化工, E-mail: 1134688407@qq.com; 陈翠霞(1979—),通信作者, 山东兖州人, 博士, 教授, 主要从事肽生物材料的制备及功能研究, E-mail: chencx@upc.edu.cn; 李凡(1981—), 通信作者, 山东临沂人, 副研究员, 主要从事渔业资源与渔业生态研究, E-mail: lifan811230@126.com

(本文编辑: 赵卫红)