基于高通量测序技术的细菌型火锅蘸料菌群结构研究

连梦瑶，张小慧，马安妮，李欢，张雪梅，魏俊桃

内蒙古草原红太阳食品股份有限公司（呼和浩特 011700）

火锅蘸料以花生酱、芝麻酱、韭菜花酱等多种原料按照一定比例，经过一定加工工艺制成，以其风味浓郁醇香、食用方便快捷、香气独特等特点受到广大消费者青睐。火锅是流行于全国各地的一种美食，融汇我国各族人民的饮食精华[1]。火锅蘸料中的花生酱含有丰富的蛋白质、维生素和矿物质等，营养丰富、风味独特，是很好的佐餐和调味品[2]。芝麻酱做工精细、香味浓郁、口感醇香且营养价值丰富，含有大量优质蛋白质、不饱和脂肪酸、木酚素和维生素E，具有抗氧化、增强免疫力、防病抗癌等功效[3]。韭菜花富含蛋白质、脂肪、糖类等营养物质，同时含有矿物质元素和维生素类物质等有益健康的成分，作为一种北方传统的调味品，韭菜花酱味道更为浓郁，常作为火锅配料食用[4-5]。

随着人们对微生物的认识，更多学者认识到微生物与食品不同风味的形成有重要联系，高通量测序技术使得食品微生物多样性研究得以发展[6-12]。马岩石等[13]基于高通量测序技术分析东北豆酱的微生物多样性，采用Illumina MiSeq高通量测序技术，对东北市售5种常见豆酱进行细菌16S rDNA V4区及真菌ITS 1~2区基因序列分析，探究其微生物的群落结构组成及其多样性。董蕴等[14]利用高通量测序技术对6个细菌型豆豉细菌多样性进行评估，并且建立核心细菌类群与滋味品质相关性的网络图，得出葡萄球菌属（Staphylococcus）和乳酸杆菌属与豆豉酸味的形成呈正相关。然而，针对火锅蘸料微生物多样性的研究少有报道。试验利用高通量测序方法对火锅蘸料的细菌菌群结构和组成进行分析比较，以期探索火锅蘸料中的腐败菌，实现对蘸料中有害菌的防治，探讨加工过程中的工艺合理性和科学性，从而实现提高火锅蘸料的品质，为提升加工水平以及工艺及设备改进提供科学依据[15-19]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

A1保温1个月火锅蘸料，A2更换包材节点多不可计，A3孜然蘸料多不可计，A4当天实验室自制火锅蘸料。取150 g左右上述火锅蘸料样品，装入无菌采样管中，储存于-20 ℃冰箱备。火锅蘸料来源为内蒙古草原红太阳食品有限公司。

E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit的试剂盒（OMEGA Bio-Tek公司）；Q10212-Qubit3.0 DNA检测试剂盒（美国Life Tech公司）；P111-03高保真酶（Vazyme Bio公司）；MagicPure® Size Selection DNA Beads（Transgen公司）；FC-410-1003基因测序试剂盒（美国Illumina公司）。

1.2 仪器与设备

Pico-21-台式离心机（美国Thermo Fisher公司）；0.5~10 μL微量可调移液器（德国Eppendorf公司）；T100TM Thermal Cyeler-PCR仪（BIO-RAD公司）；Qubit® 3.0荧光计（Invitrogen公司）；Gel-Doc凝胶成像系统（美国UVP公司）；illumina MiSeq高通量测序仪（美国Illumina公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 DNA提取

将不同编号的火锅蘸料样品搅拌均匀，根据DNA提取试剂盒说明书，结合SDS裂解液冻融法进行DNA提取，在-20 ℃储存，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，满足条带清晰则进行下一步操作。

1.3.2 测序方法

以火锅蘸料总DNA为模板进行细菌16S rDNA V3-V4区域扩增。PCR所用的引物已融合Miseq测序平台的V3-V4通用引物（341F引物：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGCCTACGGGNGGCWGCAG 805R引物：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC）进行扩增。DNA模板10 μL，高保真PCR试剂15 μL，前后F/R引物各1 μL（10 μmol/L），dd H2O 30 μL。配制好的PCR体系进行PCR扩增，反应条件：预变性94 ℃、30 min；5个循环为变性94 ℃、30 s，退火45 ℃、20 s，延伸65℃、30 s；20个循环为变性94 ℃、20 s，退火55 ℃、20 s，延伸72 ℃、30 s，终延伸72 ℃、5 min。第2轮扩增，引入Illumina桥式PCR兼容引物，PCR产物（上一轮）20 ng，高保真PCR试剂15 μL，前后F/R引物各1 μL（10 μmol/L），dd H2O 30 μL。配制好的PCR体系按照如下反应条件进行PCR扩增：预变性95 ℃、30 min；5个循环为变性94 ℃、20 s，退火55 ℃、20 s，延伸72 ℃、30 s，终延伸72 ℃、5 min，经过PCR扩增后，通过1%琼脂糖凝胶电泳检测文库大小，使用Qubit 3.0检测试剂盒对回收的DNA精确定量，按照1︰1的等量混合后测序。等量混合时，每个样品DNA量取10 ng，最终上机测序浓度20 pmol，在Illlumina NovaSeq 6000 pair-end 2×150 bp平台进行双端测序。

1.4 数据处理

使用QIIME（v.1.8.0）软件对数据进行处理，拆分和截去条码序列和引物序列后使用Usearch（v5.2.236）对每个样品的序列进行拼接，得到原始数据，去除嵌合体序列，得到最终的有效数据，默认以97%相似度以上序列聚类成操作分类单元（operational taxonomic units，OTU），使用默认参数挑选OTU的代表序列，基于SILVA128数据库对代表序列进行物种注释，进一步生成OTU列表，在各个分类水平上统计各样本的群落组成，所有样本中含量低于总序列0.001%的分类单元将被去除。序列数据分析主要使用QIIME和R包（v3.2.0）计算样品的各项数据指标。使用QIIME软件计算alpha多样性指数，通过Chao 1、Shannon、Coverage指数比较每个样本的OTUs丰度、菌群多样性；微生物群落组成分析是基于R包中Kruskal方法比较样本间各分类水平属的菌群组成结构，通过绘制Venn图和属水平分类图进行分析。

2 结果与分析

2.1 高通量测序序列统计

16S rRNA高通量测序结果通过高通量测序获得4种火锅蘸料的有效序列，并对所有有效序列进行Tags聚类分析，在97%的相似度下进行OTUs（Operational Taxo-nomic Units）聚类分析。其中A2和A3获得最多有效序列，分别为49 619和63 335，A1获得最少的有效序列。所有样品经OTU分析共计产生18 770个OTUs。

2.2 序列丰富度及多样性分析

通过对OTU的聚类和注释的结果统计，得到不同分类水平上各个样本的微生物类群组成数量，如表1所示。测序4个样本共得到142 398条有效数据。Shannon指数和Chao 1指数是衡量物种多样性和丰富度的指数。Shannon指数越高，表示物种多样性越大，Chao 1指数越高，表示物种丰富度越高。在4个火锅蘸料样品中，A1的Shannon指数为2.43，A2的Shannon指数为2.04，A3的Shannon指数1.89，A4的Shannon指数为3.28。A1的Chao 1指数为14 513.71，A2的Chao 1指数为98 344.66，A3的Chao 1指数为146 864.84，A4的Chao 1指数为22 961.53。经检验发现，隶属于不同火锅蘸料样品中的细菌类群在Shannon指数（P＞0.05）、Chao 1指数（P＞0.05）均不具有显著性差异。由此可见，4个火锅蘸料中的细菌多样性和丰富度较为均一。结果表明，4个火锅蘸料虽然存放条件或时间有所不同，后续储存过程中可能并未掺杂入大量其他细菌，因此4个火锅蘸料的细菌类群较为相似。

表1 高通量测序样品16S rDNA测序情况及分类情况

由图1可知，在测序深度达到5 000条左右时，所有的Shannon稀释曲线均已进入平台期，说明细菌微生物多样性不会随之增加。表1中，A3样本的有效序列数均达到60 000条，A2样本的有效序列数均达到40 000条，A4样本的有效序列数均达到20 000条，A1样本的有效序列数均达到5 000条。Simpson指数代表群落中种数个体分配的均匀程度，Simpson指数越高，群落多样性越好，可以反映A2和A3样品中微生物种类丰富，A1和A4样品中微生物种类少。

图1 Alpha指数稀疏曲线图

Rank-abundance曲线是分析多样性的一种方式。构建方法是统计单一样品中，每一个OTU所含的序列数，将OTUs按丰度（所含有的序列条数）由大到小等级排序，以OTU等级为横坐标，以每个OTU中所含的序列数（也可用OTU中序列数的相对百分含量）为纵坐标做图。Rank-abundance曲线用于同时解释样品多样性的两个方面，即样品所含物种的丰富程度和均匀程度。物种的丰富程度由曲线在横轴上的长度反映，曲线越宽表示物种的组成越丰富；物种组成的均匀程度由曲线的形状反映，曲线越平坦，表示物种组成的均匀程度越高。由图2可知，4个火锅蘸料样品中物种的丰富程度与均匀程度相差不大。

图2 Rank Abundance曲线图

2.3 序列丰富度及多样性分析

对测序获得的有效数据进行聚类分析，以97%相似度以上的序列聚类成OTUs，并根据不同类型火锅蘸料绘制维恩图（图3）。A1中含有的OTUs是951，A2中含有的OTUs是6 589，A3中含有的OTUs是8 897，A4中含有的OTUs是3 066。说明4个样本中的细菌种类A3＞A2＞A4＞A1。A1和A2样品中相同的OTUs有32个，A1和A3样品中相同的OTUs有17个，A1和A4样品中相同的OTUs有105个。A2和A3样品中相同的OTUs有569个，A2和A4样品中相同的OTUs有52个，A3和A4样品中相同的OTUs有22个。4个火锅蘸料样品中有13个共有的OTUs，这些微生物起着重要作用。

图3 4种火锅蘸料中的OTUs维恩图

2.4 细菌属水平上的分布特征

基于属水平上的分类学对4种火锅蘸料中最具优势的11个属绘制分类图，如图4（不同色块宽度表示不同物种相对丰度比例）所示。A1中主要的细菌类群为黄单胞菌属（Xanthomonas）、凯斯特鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、乳杆菌属（Lactobacillus）、未分类菌属（Unclassified）以及嗜热嗜碱产芽孢杆菌属（Caldalkalibacillus），丰度逐个降低；A2中依次为芽孢杆菌属（Bacillus）、未分类菌属（Unclassified）、黄单胞菌属（Xanthomonas）、异杆菌属（Allobacillus）、凯斯特鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）；A3则主要由芽孢杆菌属（Bacillus）、未分类菌属（Unclassified）、异杆菌属（Allobacillus）、黄单胞菌属（Xanthomonas）组成；A4中主要的细菌类群为黄单胞菌属（Xanthomonas）、凯斯特鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、未分类菌属（Unclassified）、肠杆菌属（Enterobacter）及嗜热嗜碱产芽孢杆菌属（Caldalkalibacillus），丰度逐个降低。A1和A4中均以黄单胞菌属（Xanthomonas）为优势菌属，A2和A3中均以芽孢杆菌属（Bacillus）为优势菌属。秩和检验结果显示，A2和A3火锅蘸料中芽孢杆菌属相对丰度无显著性差异（P＞0.05），表明芽孢杆菌属细菌类群在A2和A3火锅蘸料中较为恒定。A1和A4火锅蘸料中黄单胞菌属相对丰度无显著性差异（P＞0.05），表明黄单胞菌属细菌类群在A1和A4火锅蘸料中较为恒定。从图4还可知，4个火锅蘸料样本间的菌属组成存在一定差异性，可能原因为不同存放环境对此类产品细菌群落有一定影响。

图4 genus水平所有样本群落结构分布图

2.5 物种丰度热图

物种丰度聚类热图分析是通过颜色变化与相似程度反映表格中的数据信息，并呈现群落物种的组成信息，表明火锅蘸料不同样品间不同细菌属的相对丰度及细菌组成的差异性和样品间的相似性[20-21]。采用物种丰度聚类热图分析火锅蘸料样品中含量前11个菌属和4个样品之间的交互关系，见图5。不同样品间属水平具有一定丰度，且各样品的菌群组成具有一定差异性和相似性。同时，根据丰度聚类热图可以看出样品间属水平的聚类关系，即4组样品均聚在一起，说明4组样品间的丰度相似，其中A1和A4的相似度较高些，A2与A3的相似度较高些。

图5 基于属水平各样品的物种丰度聚类热图

3 讨论与结论

采用高通量测序对4种不同处理方式火锅蘸料的细菌菌群结构，结合丰度聚类热图和α多样性进行分析。测序4个样本共得到142 398条有效数据，18 770个OTUs。通过高通量基因测序技术，对4种不同处理方式火锅蘸料微生物的多样性和丰度进行鉴定，分析火锅蘸料中可能影响火锅蘸料品质的菌株，为火锅蘸料的安全生产提供科学依据。A1中主要的细菌类群为黄单胞菌属（Xanthomonas）、凯斯特鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、乳杆菌属（Lactobacillus）、未分类菌属（Unclassified）及嗜热嗜碱产芽孢杆菌属（Caldalkalibacillus），丰度逐个降低；A2中依次为芽孢杆菌属（Bacillus）、未分类菌属（Unclassified）、黄单胞菌属（Xanthomonas）、异杆菌属（Allobacillus）、凯斯特鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）；A3则主要由芽孢杆菌属（Bacillus）、未分类菌属（Unclassified）、异杆菌属（Allobacillus）、黄单胞菌属（Xanthomonas）组成；A4中主要的细菌类群为黄单胞菌属（Xanthomonas）、凯斯特鞘氨醇单胞菌属（Sphingomonas）、未分类菌属（Unclassified）、肠杆菌属（Enterobacter）以及嗜热嗜碱产芽孢杆菌属（Caldalkalibacillus），丰度逐个降低。A1和A4中均以黄单胞菌属（Xanthomonas）为优势菌属，A2和A3中均以芽孢杆菌属（Bacillus）为优势菌属。这2种都是腐败微生物，火锅蘸料中含量超标会对人体健康产生一定的影响。通过物种丰度聚类热图可以看出样品间属水平的聚类关系，即4组样品均聚在一起，说明4组样品间的丰度相似，其中A1和A4的相似度较高些，A2与A3的相似度较高些。在火锅蘸料生产中，可根据这些微生物的生存特性对其进行控制，通过鉴定火锅蘸料中微生物组成，可以在生产中针对性地抑制有害微生物。火锅蘸料中存在微生物污染情况，并存在致病风险。高通量测序比传统平板培养微生物更加快速和全面获得火锅蘸料中的微生物群落特征信息。本研究实现对火锅蘸料中有害菌的防治，提升加工水平，为工艺及设备改进提供科学依据，从而实现提高火锅蘸料的品质。