竹虫蛋白肽的制备及其活性研究

朱静静，王艳萍，唐川惠，早春娟

德宏职业学院（德宏 678400）

竹虫，又名竹蛆、竹蠹螟，属鳞翅目螟蛾科昆虫，国内主要分布于云南南部的西双版纳州、德宏州、红河州等地区，寄生在竹筒内，是云南当地少数民族的传统美食[1-2]。研究表明，竹虫在云南德宏为1年1代，卵最早7月上旬出现，至9月上旬结束；幼虫最早于7月上旬出现，至次年6月中旬结束，次年5月中开始化蛹，整个幼虫期长达300 d左右；蛹最早于5月中旬出现，于9月下旬结束，蛹期50 d左右；成虫7月初开始出现，9月上旬结束[3-4]。

相关研究表明，昆虫是一类高质量的动物蛋白质资源口[5-8]。昆虫体内的蛋白质含量丰富，在已有营养成分分析中表明，近百种食用昆虫中，无论供食用的虫态是卵、幼虫、蛹还是成虫，其蛋白质含量均十分丰富，粗蛋白含量一般在20%~70%[9-12]。王琦等[13]对竹虫的氨基酸、糖、脂肪等营养成分和无机元素与维生素等进行分析，结果表明竹虫含有丰富的蛋白质、脂肪及B族维生素和维生素PP等。陈晓鸣等[9]对竹虫的营养成分进行分析，结果表明竹虫蛋白质含量可达30%~40%，氨基酸含量为29.9%，粗脂肪含量为60.42%，不饱和脂肪酸含量为55.9%，营养丰富。张美玲等[14]对竹虫菌落总数和大肠杆菌群进行测定，结果发现其肠道内含有沙门菌和志贺菌等致病菌，因此竹虫须高温油炸后才能食用。

试验旨在用蛋白酶水解制备竹虫蛋白肽，得出最佳制备工艺，并研究其抗氧化活性及对小鼠肺成纤维细胞增殖活性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 试验材料与试剂

竹虫（云南西双版纳）；胰蛋白酶（250 U/mg）、碱性蛋白酶（200 000 U/g）、胃蛋白酶250 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 000 U/g），北京索莱宝科技有限公司；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）、氢氧化钠、无水硫酸铜、酒石酸钾钠，昆明傲雪科技有限公司。

1.1.2 试验仪器与设备

SHZ-82恒温振荡器（金坛市大地自动化仪器厂）；URA14M0018分光光度计（上海翱艺仪器有限公司）；TGL20M高速冷冻离心机（湖南湘立科学仪器有限公司）；HWS24型水浴锅（金坛市城西丽华实验仪器厂）。

1.2 方法

1.2.1 竹虫粗蛋白制备

1.2.1.1 试验材料预处理

冷冻竹虫加液氮研磨，过0.850 mm（20目）筛，自然风干除去水分，竹虫粉与无水乙醚按照1︰30（g/mL）的比例进行脱脂，自然风干，得到脱脂竹虫粉，密封保存备用。

1.2.1.2 竹虫蛋白的制备

根据陈翔宇等[15]的研究加以改进。称取1 g脱脂竹虫粉，加入30 mL 1.4 mol/L的氢氧化钠溶液，于50 ℃恒温振荡20 min，按4 000 r/min离心20 min，取上清液，加1 mol/L的稀盐酸调节至等电点pH 4.4，离心收集沉淀，冷冻干燥即得竹虫粗蛋白。

1.2.2 竹虫蛋白肽的制备

1.2.2.1 蛋白肽水解酶的筛选

分别取胰蛋白酶（250 U/mg）、碱性蛋白酶（200 000 U/g）、胃蛋白酶（250 U/mg）、木瓜蛋白酶（800 000 U/g），按照各种酶的包装标签设置不同条件（胰蛋白酶pH 7.6~8.0、37~40 ℃，碱性蛋白酶pH 9.0~12.0、40~50 ℃，胃蛋白酶pH 2.0~4.0、低于60℃，木瓜蛋白酶pH 6.0~7.0、40~60 ℃），对竹虫蛋白进行水解，根据肽得率选择最佳提取蛋白酶。

1.2.2.2 标准曲线的绘制

根据相关研究方案加以改进[16-18]。分别取0.2，0.4，0.6，0.8和1.0 mL 2 mg/mL的谷胱甘肽（GSH）于10 mL容量瓶中，补加蒸馏水至10 mL，摇匀，各取2 mL于10支试管内，分别依次加入1 mL 0.02 g/mL酒石酸钾钠、1 mL 5%氢氧化钠、0.3 mL 1%硫酸铜，摇匀，静置10 min，于310 nm波长处测定吸光度。计算得到标准曲线方程y=0.502 3x-0.135 1，R2=0.991 7。（y为吸光度；x为谷胱甘肽含量，mg/mL）

样品的测定，将谷胱甘肽换成样品即可。

1.2.2.3 蛋白肽的制备工艺研究

称取1 g竹虫蛋白，加30 mL蒸馏水溶解，调节pH 7.68~8.00，加胰蛋白酶水解，沸水浴灭酶10 min，按5 000 r/min离心20 min，取10 mL上清液，加入10 mL 10% TCA溶液，混匀，静置10 min，离心（5 000 r/min，20 min），上清液于60 ℃水浴5 min，取2 mL，依次加入1 mL 0.02 g/mL酒石酸钾钠、1 mL 5%氢氧化钠、0.3 mL 1%硫酸铜，摇匀，静置10 min，蒸馏水代替样品作为空白调零，测定吸光度，计算肽得率。

1.2.3 单因素试验

研究不同加酶量（60，70，80，90和100 mg/g）、不同水解温度（30，35，40，45和50 ℃）、不同水解时间（30，60，90，120和150 min）和不同pH（6，7，8，9和10）对竹虫蛋白肽得率的影响情况。

1.2.4 响应面试验设计竹虫蛋白肽提取工艺

参照单因素结果，利用Box-Behnken试验设计，进行四因素三水平的试验设计，优化竹虫蛋白肽提取的工艺参数。响应面分析因素及水平见表1。

表1 响应面分析因素及水平表

1.2.5 竹虫蛋白肽的分离

用分子量10和5 kDa的超滤膜分级过滤水解液，使不同分子量的多肽从溶液中分离出来，得到不同分子量段（MW＞10 kDa、5 kDa＜MW＜10 kDa、MW＜5 kDa）的竹虫蛋白肽，冷冻干燥，于-80 ℃保存备用。

1.2.6 竹虫蛋白肽活性研究

1.2.6.1 DPPH自由基清除能力测定

参考吴晖等[19]的方法，将2 mL无水乙醇与2 mL 2.0 μmol/mL的DPPH-乙醇溶液，加入同一试管中，摇匀，暗处静置30 min，用无水乙醇做参比，于波长517 nm处测定吸光度A0；测定样品清除能力时，将2 mL样品与2 mL DPPH-乙醇溶液，于试管中混匀，暗处静置30 min，以同浓度样品液作为参比，于波长517 nm处测定吸光度A1，竹虫蛋白肽清除率按式（1）计算。

1.2.6.2 MTT小鼠肺成纤维细胞增殖试验[20-21]

收集对数生长期的小鼠肺成纤维细胞，细胞密度调整至103~104个/孔，在96孔平底板中每孔加入200 μL，在5% CO2、37 ℃培养箱中培养24 h，待细胞贴壁，加入100 μL不同浓度梯度（0，0.64，3.2，16，80，100和400 μg/mL）的竹虫蛋白肽，每个浓度设6个重复。继续在5% CO2、37 ℃培养箱中培养24 h，培养结束后，用100 μL新鲜培养基更新，内含每孔20 μL 5 mg/mL的MTT溶液，孵育4 h显色。弃去培养液，用PBS清洗2次，每孔加入150 μL DMSO，于37 ℃振荡培养10 min，使紫色结晶物溶解，用酶联仪测定吸光度（以空白调零），通过与对照组比较得到试验组的存活率。各组吸光度取平均值后，细胞存活率按式（2）计算。

2 结果与分析

2.1 最佳酶的确定

由图1可知，利用胰蛋白酶提取竹虫蛋白肽得率最高，为200.321 mg/g，因此选择胰蛋白酶为最佳提取酶。木瓜蛋白酶与胃蛋白酶提取的得率较低的原因可能是2种酶的最适pH为酸性，提取蛋白肽的蛋白质是通过碱提酸沉法制得的，酸性环境可能会使蛋白继续沉淀，导致酶提效果较弱。

图1 竹虫蛋白肽最佳提取酶的确定

2.2 单因素试验

2.2.1 加酶量的确定

称取5份1 g竹虫蛋白粉置于5个烧杯中，分别加入30 mL蒸馏水，调节pH 7.68~8.00，分别加入60，70，80，90和100 mg胰蛋白酶，于40 ℃恒温振荡60 min。

由图2可知，随着加酶量的增多，肽得率呈现先增后减的趋势，加酶量80 mg/g时肽得率最大，为245.980 mg/g。加酶量增加到一定值时，底物被酶所饱和，底物上可供酶所切割的位点有限，此时进一步增加酶量，水解度不会有更大的变化[22]。

图2 竹虫蛋白肽提取加酶量的确定

2.2.2 最佳水解温度的确定

称取5份1 g竹虫蛋白粉置于5个烧杯中，分别加入30 mL蒸馏水，调节pH 7.68~8.00，各加入80 mg/g胰蛋白酶，分别于30，35，40，45和50 ℃恒温振荡60 min。

由图3可知，竹虫蛋白肽得率随着温度的升高呈现先增后减的趋势，其中40 ℃时的肽得率最高，为251.260 mg/g，40 ℃是胰蛋白酶的最佳作用温度，水解温度的高低与蛋白酶分子的稳定性有关，这是因为蛋白酶分子的肽键具有特定的空间结构，如果反应温度太高，会引起蛋白分子的次级键进行解离，从而使蛋白酶丧失或部分丧失催化活性；若反应温度过低，则会降低体系内蛋白分子运动的激烈程度，从而降低底物与蛋白酶的碰撞概率[23]。

图3 竹虫蛋白肽最佳水解温度的确定

2.2.3 最佳水解时间的确定

称取5份1 g竹虫蛋白粉置于5个烧杯中，分别加入30 mL蒸馏水，调节pH 7.68~8.00，各加入80 mg/g胰蛋白酶，分别于40 ℃恒温振荡30，60，90，120和150 min。

由图4可知，竹虫蛋白肽的得率随着水解时间的延长呈现先增后减的趋势，水解120 min时肽得率最高，为309.019 mg/g，可能是随着时间的延长，蛋白肽被降解成氨基酸。

图4 竹虫蛋白肽最佳水解时间的确定

2.2.4 最佳水解pH的确定

称取5份1 g竹虫蛋白粉置于5个烧杯中，分别加入30 mL蒸馏水，调节pH至6，7，8，9和10，各加入80 mg/g胰蛋白酶，分别于40 ℃恒温振荡120 min。

由图5可知，随着pH的升高，肽含量先增后减，pH 8时肽含量最高，为288.314 mg/g，胰蛋白酶的最适反应pH是8，过酸或过碱均可以破坏酶的空间结构，引起酶构象的改变，使酶丧失活性；pH变化不很剧烈时，酶虽未变性，但pH可影响底物的解离情况，也可影响酶分子活性部位上一些相关基团的解离，从而导致酶与底物的结合或催化；pH可以影响与维持酶分子空间结构的有关基团的解离，从而导致酶分子活性部位的构象变化，进而影响酶的生物活性[24]。

图5 竹虫蛋白肽最佳水解pH的确定

2.3 竹虫蛋白肽最佳水解工艺的确定

2.3.1 响应面试验设计及结果

根据单因素试验结果，利用Design-Expert 8.0软件进行试验模型设计，得出表2所示的响应面试验方案及结果。

表2 响应面试验方案及结果

2.3.2 模型建立及显著性检验

经过对表2的分析，得到竹虫蛋白肽的多肽得率与加酶量（A）、水解温度（B）、水解时间（C）、水解pH（D）的二次方程模型：Y=303.67+23.86A+8.56B+12.53C+26.92D+4.23AB+1.85AC-4.43AD+12.00BC+15.71BD-1.81CD-14.42A2-10.01B2-25.49C2-4.31D2。

回归模型方差分析结果见表3。肽得率回归模型显著性检验P＜0.000 1＜0.01，说明两者二次多元回归模型极显著；回归模型失拟性检验P=0.102 2＞0.05，所选肽得率二次回归模型与实际试验拟合性充分模型失拟不显著。多肽得率回归诊断表明，决定系数R2=0.995 5，信噪比=32.612。方程的拟合度和可信度很高，可用于竹虫蛋白肽得率计算。综上所述，回归模型拟合程度良好，试验误差小，能够准确分析和预测竹虫蛋白酶解液的蛋白肽得率，说明试验操作可信度高，具有一定实践指导意义。

表3 竹虫蛋白肽含量回归模型方差分析表

由回归系数显著性表明，各因素对竹虫蛋白肽提取效果影响的顺序为pH＞温度＞加酶量＞时间。

2.3.3 响应面分析

响应面与等高线的稀疏程度可直观地反映加酶量、温度、时间、pH之间的交互作用对竹虫蛋白肽得率的影响，等高线呈圆形时表示两因素交互作用不显著，而呈椭圆形或马蹄形时则表示两因素交互作用显著[25-26]。

由图6可以看出，随着温度和时间、pH的上升蛋白肽得率明显增多，说明温度与时间、温度与pH的交互作用对竹虫蛋白肽得率影响显著。与方差分析结果一致。

图6 各因素交互作用对竹虫蛋白肽得率影响的响应面

2.3.4 最佳条件的确定和最佳模型的验证

回归模型通过响应面法得到制备竹虫蛋白肽的最优工艺条件：加酶量80 mg/g、温度45 ℃、时间120 min、pH 10.0，蛋白肽得率预测值为326.277 mg/g；为验证该模型预测的准确性，在此条件下进行3次重复试验，竹虫蛋白肽得率为320.215 mg/g，接近预测值，证明模型可靠。

2.4 竹虫蛋白肽活性研究结果

2.4.1 抗氧化活性

由图7可知，5 kDa＜MW＜10 kDa的竹虫蛋白肽DPPH自由基清除活性最强，在10 mg/mL时自由基清除活性为66.23%。

图7 竹虫蛋白肽抗氧化活性研究

2.4.2 不同分子量段的竹虫蛋白肽对小鼠肺成纤维细胞增殖的影响

将不同浓度（0，0.64，3.2，16，80，100和400 μg/mL）的竹虫蛋白肽分别加入小鼠肺成纤维细胞培养基中，培养24 h后计数细胞增殖情况，如图8和图9所示。试验结果表明，培养基中添加MW＜5 kDa（3.2，16和80 μg/mL）、5 kDa＜MW＜10 kDa（400 μg/mL）的竹虫蛋白肽均能显著促进小鼠肺成纤维细胞的增殖，说明竹虫蛋白肽具有促进小鼠肺成纤维细胞增殖的活性。

图8 MW＜5 kDa的蛋白肽对细胞增殖作用的影响

图9 5 kDa＜MW＜10 kDa的蛋白肽对细胞增殖作用的影响

3 结论

3.1 竹虫蛋白的制备

按竹虫粉与无水乙醚1︰30（g/mL）的比例脱脂效果较好，对后期试验干扰较小。采用碱提酸沉法进行竹虫蛋白质的制备，用1.4 mol/L的NaOH溶液于50℃浸提60 min，用10 mol/L和1 mol/L的盐酸溶液调节pH至竹虫蛋白等电点（pH 4.4）使蛋白质沉淀，冷冻干燥备用。

3.2 竹虫蛋白肽制备工艺研究

采用碱性蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶和木瓜蛋白酶进行水解，结果表明胰蛋白酶对竹虫蛋白肽的水解效果较好。在单因素试验基础上，采用响应面试验确定竹虫肽的最佳水解工艺：加酶量80 mg/g、温度45℃、时间120 min、pH 10.0，在此最佳条件下肽得率为320.215 mg/g。

3.3 竹虫蛋白肽活性研究

采用超滤分离得到的不同分子量段（MW＞10 kDa、5 kDa＜MW＜10 kDa、MW＜5 kDa）的竹虫蛋白肽均具有抗氧化活性，其中，MW＜5 kDa的竹虫蛋白肽对DPPH自由基清除活性较强，且随着浓度的增加而不断增强，肽质量浓度10 mg/mL时自由基清除率为66.23%，说明竹虫蛋白肽具有较强的抗氧化活性；把不同浓度竹虫蛋白肽作用于小鼠肺成纤维细胞，结果表明竹虫蛋白肽能够促进小鼠肺成纤维细胞增殖。