新型复合水果酵素饮料的研制及其特性分析

张豪 ，肖盼盼，古敏晴，李飞飞，何益峰，李文保

1.深圳市华大海洋生物医药技术研究院（深圳 518000）；2.深圳华大海洋科技有限公司（深圳 518000）

生活节奏的加快和生活压力的变大，导致生活规律和饮食结构的改变，一方面高糖、高蛋白、高热量食物摄取过多，另一方面膳食纤维等促进肠道蠕动的食物摄入量减少，导致便秘在日常生活中较为频繁地出现。其临床的表现为大便干结、排便艰难、排便时间延长等主要症状[1]。长期服用药物治疗便秘会产生一定的依赖性和副作用，便秘人群也对药物的治疗方法心存担忧[2]。因此研发出具有润肠通便功能的创新型功能性食品越来越受到关注。

人体内有多种自由基，尤以氧自由基最多，自由基与人类的衰老和许多疾病相关[3]，近年来越来越多的学者将目光投入海洋天然抗氧化活性物质的研究中，相关研究报道较多，结果也证实多种海洋生物中提取的多肽物质具有体内外抗氧化活性[4-9]，并显示较好应用前景。

探究不同因素对复合水果酵素感官的影响，优化复合水果酵素工艺配方，并检测其体外抗氧化活性和体内对便秘小鼠的便秘改善情况，旨在研发一款安全性高，抗氧化性较强，同时能够有效缓解便秘的复合水果酵素饮料。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

复合水果酵素[晶叶（青岛）生物科技有限公司]；盐酸洛哌丁胺（规格2 mg×6粒，西安杨森制药有限公司）；阿拉伯树胶粉、活性炭粉（北京宝瑞杰科技有限公司）；市售酵素竞品1和2（购自于网络购物平台）。

1.2 仪器与设备

AUW120D型电子天平[岛津企业管理（中国）有限公司]；DHG-914A电热鼓风干燥箱（上海一恒科学仪器有限公司）；Varioskan LUX全波长酶标仪（美国赛默飞世尔科技）；DHS-16A电子水分测定仪（宁波市鄞州华丰电子仪器厂）。

1.3 试验动物

SPF级健康雄性ICR小鼠120只（18.0~22.0 g，辽宁长生生物科技股份有限公司）。SPF级动物房，温度25±2 ℃，湿度40%~70%。

1.4 试验方法

1.4.1 工艺流程

原料预处理→水果酵素原液稀释→加入适量糖醇→加入适量鱼皮胶原肽粉→混匀→杀菌→灌装→成品1.4.2 优化试验

1.4.2.1 单因素试验

以水果酵素添加量（50%，60%，70%，80%和90%）、糖醇添加量（11.5%，15.0%，18.5%，22.0%和25.5%）、鱼皮胶原蛋白肽粉添加量（0.5%，1.0%，1.5%，2.0%和2.5%）为主要影响因素，探究其对产品感官品质得分的影响。

1.4.2.2 正交试验

根据单因素试验结果，以水果酵素添加量、糖醇添加量、鱼皮胶原蛋白肽粉添加量为自变量，以感官评分为指标，进行配方优化，设计正交试验，确定最佳工艺配方。

表1 正交试验设计因素水平表 单位：%

1.4.2.3 感官评分标准

参考刘旺等[10]的方法对产品进行感官评定，评分标准见表2。

表2 感官评分标准表

1.4.3 体外抗氧化活性测定

参考张瑞刚等[11]、曹明原等[12]的方法检测复合水果酵素的体外抗氧化活性。

1.4.4 动物饲养与分组

将试验雄性ICR小鼠饲养在安静、清洁、通风的环境（温度25±2 ℃；湿度40%~70%）中，确保小鼠自由饮水、进食和正常活动及睡眠。将小鼠按其质量随机分为5组（空白对照组、模型对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组），每组10只。剂量组分为低剂量组、中剂量组和高剂量组，综合复合水果酵素每天按8.3，16.6和25.0 mL/kg，模型对照组和空白对照组给与蒸馏水，连续灌胃15 d后，观察小鼠的体重变化、小肠推进试验和排便试验。

1.4.5 小鼠小肠推进试验

配制墨汁[13]：准确称取100 g阿拉伯树胶，加800 mL水，煮沸至溶液透明，称取50 g活性碳（粉状）至上述溶液中煮沸3次，待溶液冷却后加水定容至1 000 mL，于4 ℃冰箱保存，用前摇匀。

小鼠经过按不同剂量连续灌胃15 d后，将小鼠禁食不限制水饲喂16 h，各组经口灌胃5 mg/（kg·bw）盐酸洛哌丁胺，建模0.5 h后将5组试验小鼠分别灌胃2 mL/（kg·bw）墨汁，25 min后脱颈椎处死小鼠，打开腹腔分离肠系膜，剪取上端自幽门、下端至回盲部的肠管，置于托盘上，轻轻将小肠拉成直线，测量肠管长度为“小肠总长度”，从幽门至墨汁前沿为“墨汁推进长度”。按式（1）计算墨汁推进率。

1.4.6 小鼠排便试验

同1.4.5中构建小鼠便秘模型、同等灌胃剂量。5组小鼠经墨汁灌胃后，正常饮水，记录每只小鼠首次排出黑便时间和每组小鼠在5 h内黑便排出粒数和质量。

1.4.7 数据处理

采用SPSS 18.0软件进行数据统计分析，组间比较采用双尾t-检验，其中P＜0.05代表有显著性差异，P＜0.01和P＜0.001代表有极显著性差异。选用Graphpad Prism 6软件作图。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 水果酵素添加量对感官评分的影响

水果酵素作为最主要的原料之一，其对饮料感官评分的影响如图1所示。随着添加量的增加，感官评分呈现先升高后降低趋势，其最适添加量为80%。

图1 水果酵素添加量对感官评分的影响

2.1.2 糖醇添加量对感官评分的影响

糖醇被越来越广泛用于食品中[14]。水果酵素本身具有一定的甜度，因此糖醇对产品的感官评分有较大影响，甜度影响尤为明显。图2表明，糖醇添加量18.5%时，口感最好，因此其最适添加量为18.5%。

2.1.3 鱼皮胶原蛋白肽粉添加量对感官评分的影响

鱼皮胶原蛋白肽，因其分子量小，溶解性好，易被人体肠道吸收，被广泛用于保健食品中[15-16]。图3显示，鱼皮胶原蛋白肽粉最适添加量为1.0%。

图3 鱼皮胶原蛋白肽粉添加量对感官评分的影响

2.2 配方优化

2.2.1 正交试验结果及方差分析

依据单因素试验结果，以水果酵素添加量、糖醇添加量和鱼皮胶原蛋白肽粉添加量3个因素进行L9(33)正交优化试验，以感官评分为主要测试指标，确定复合水果酵素最佳配方工艺。由表3的试验结果可知，3个因素对感官评分影响的主次顺序为A＞C＞B，即水果酵素添加量＞鱼皮胶原蛋白肽粉添加量＞糖醇添加量。此外，初步判断试验最优组合为A2B1C2，即水果酵素添加量80%、糖醇添加量18.5%、鱼皮胶原蛋白肽粉添加量1.0%。

表3 正交试验结果及分析

2.3 复合水果酵素体外抗氧化试验

将酵素原液计为100 mg/mL对其进行体外抗氧化活性检测。

2.3.1 清除DPPH自由基试验结果

DPPH是一类非常稳定存在的自由基，在517 nm时有最大吸收，且浓度与吸光度呈线性相关。抗氧化剂对自由基的清除能力以IC50评价，IC50值越小，清除力越强[17]。如图4所示，其与复合水果酵素浓度能很好地反映线性关系，由此，得出复合水果酵素清除DPPH自由基的公式：Y=663.98X+28.368，其中R2=0.993。经拟合计算，复合水果酵素50%自由基清除率对应的稀释比例（IC50）为1/3 030.3。

图4 复合水果酵素清除DPPH自由基结果

2.3.2 清除ABTS自由基试验结果

ABTS自由基是一种稳定存在的自由基，其清除能力是评价亲水性和亲脂性物质的抗氧化能力的指标之一[18]。如图5所示，其与复合水果酵素浓度都能很好地反映线性关系，由此，得出复合水果酵素清除ABTS自由基的公式：Y=224.51X+3.151，其中R2=0.997。经拟合计算，复合水果酵素50%自由基清除率对应的稀释比例（IC50）为1/476.2。

图5 复合水果酵素清除ABTS自由基结果

2.3.3 清除超氧化阴离子自由基试验结果

超氧阴离子自由基是活性氧自由基的一种，而且是单线态氧还原的第一个产物，可以促进多种氧自由基的形成，可以诱导脂类、蛋白质、核酸等的氧化损伤[19]。如图6所示，虽然随着酵素浓度的不断增大，超氧化阴离子自由基清除率也逐渐增大，但是两者并没有呈现线性关系。经计算，复合水果酵素50%自由基清除率对应的稀释比例（IC50）为1/28.90。

图6 复合水果酵素清除超氧化阴离子自由基结果

2.4 体内小鼠试验

2.4.1 小鼠墨汁推进率试验中体重的变化

为确定服用复合水果酵素饮料的安全性，测定其对小鼠体重的影响。小鼠小肠墨汁推进率试验过程中体重的变化如表4所示。各组间小鼠体重变化无显著差异（P＞0.05），整个试验过程中小鼠饮食饮水正常，活动良好，无呕吐、腹泻、嗜睡等不良反应，体重出现逐渐上升趋势，说明复合水果酵素饮料对小鼠体重无明显影响。

表4 小鼠小肠运动中体重变化

2.4.2 小鼠排便试验中小鼠体重变化

小鼠粪便试验中体重变化如表5所示。各组间小鼠体重变化无显著差异（P＞0.05），整个试验过程中小鼠饮食饮水正常，活动良好，无呕吐、腹泻、嗜睡等不良反应，体重出现逐渐上升趋势，说明复合水果酵素饮料对小鼠体重无明显影响。2.4.3 小鼠墨汁推进率试验结果

表5 小鼠排便试验中体重变化

为探究复合水果酵素饮料润肠通便功效，通过测定小鼠服用不同剂量酵素后小肠内墨汁推进率，结果如表6所示。模型对照组的墨汁推进率为34.82%，显著低于空白对照组（P＜0.001），说明构建小鼠便秘模型成功[20]。

表6 小鼠墨汁推进率试验结果

小鼠墨汁推进率试验结果表明：低剂量组、中剂量组和高剂量组对比模型对照组，墨汁推进率均有所提升，服用剂量越高，墨汁推进率越高，服用高剂量的小鼠墨汁推进率达71.95%，显著（P＜0.001）缩短粪便在肠道内滞留时间。分析其发挥作用的主要功效因子可能是饮品中含有低聚糖和水溶性膳食纤维，低聚糖被有益菌发酵产生短链脂肪酸如丁酸等，降低肠道pH，促进肠道蠕动[21]，同时水溶性膳食纤维可缩短内容物（粪便）通过肠道的时间，降低结肠的压力，减少肠内有害物质和肠壁接触的时间，促进肠道运动[22]。

2.4.4 小鼠排便试验结果

经小鼠墨汁灌胃试验，通过测定首粒黑便排出时间和5 h内排便粒数来探究小鼠服用复合水果酵素饮料的润肠通便作用，试验结果如表7所示。小鼠首粒黑便排出时间和5 h内排黑便粒数的空白对照组和模型对照组存在显著差异（P＜0.05），小鼠便秘试验模型构建成功。

表7 小鼠排便试验结果

小鼠排便试验结果显示：低剂量组与模型对照组相比，首粒排黑便时间明显缩短（P＜0.05），黑便粒数显著增多（P＜0.01），黑便质量明显增加（P＜0.01），表明该饮料在给予低剂量时就能明显缩短首粒排黑便时间，并增加黑便粒数及黑便质量，具有促排便作用。中剂量组、高剂量组与模型对照组比较，首粒排黑便时间、粪便粒数及粪便质量结果无显著差异性，可能由于其服用剂量过大，超出小鼠的适宜服用量，造成小鼠有饱腹感，胃肠道蠕动减弱，导致代谢减缓[23]。

2.4.5 复合水果酵素饮料与市售竞品对比小鼠墨汁推进率试验结果

表8显示新型复合水果酵素与目前在售的酵素产品在润肠通便功效作用的对比。与对照组相比，模型组墨汁推进率显著降低（P＜0.001），说明小鼠便秘模型构建成功。与模型对照组相比，复合水果酵素饮料组、竞品酵素1组、竞品酵素2组小鼠的墨汁推进率均高于模型组（分别是P＜0.001，P＜0.01和P＜0.05）。说明3组产品均可发挥润肠通便作用，同时复合水果酵素组小鼠的墨汁推进率显著高于竞品酵素1组和竞品酵素2组小鼠（分别是P＜0.05和P＜0.01）。结果表明新型复合水果酵素产品的促小肠蠕动效果显著好于其他2款市售竞品酵素。

表8 与市售酵素竞品对比小鼠墨汁推进率试验结果

2.4.6 复合水果酵素饮料与市售竞品对比小鼠排便试验结果

从表9试验结果对比发现，与对照组相比，模型组首粒黑便时间显著上升（P＜0.001），黑便粒数和黑便质量显著降低（分别是P＜0.05和P＜0.01），说明使用小鼠便秘模型构建成功。与模型对照组相比，复合水果酵素组、竞品酵素1组、竞品酵素2组小鼠的首粒黑便时间均低于模型组（分别是P＜0.001，P＜0.05和P＜0.05）。并且复合水果酵素组小鼠的首粒黑便时间显著低于竞品酵素1组和竞品酵素2组小鼠（均为P＜0.05）；与模型组相比，复合水果酵素组的黑便粒数高于模型组（P＜0.05）。复合水果酵素组小鼠的黑便粒数显著高于竞品酵素2组小鼠（P＜0.05）。在黑便质量指标上，复合水果酵素组小鼠的黑便质量显著高于竞品酵素1组和竞品酵素2组（分别是P＜0.05和P＜0.05）。试验数据表明复合水果酵素产品的促排便效果显著好于其他2款市售竞品酵素。

表9 与市售酵素竞品对比小鼠排便试验结果

2.5 产品营养及质量检测

对研发的复合水果酵素饮料进行营养及质量检测，结果显示（表10），各项营养测试及理化参数指标均符合国家相关标准要求，是一款价值较高的安全产品。

表10 产品检测结果

3 结论

试验以水果酵素、鱼皮胶原蛋白肽等为主要原料，研制一款复合水果酵素饮料，通过单因素影响及正交试验确定最佳配方：水果酵素添加量80.0%、糖醇添加量18.5%、鱼皮胶原蛋白肽粉添加量1%。以该比例调制的复合水果酵素饮料颜色均匀、有光泽，酸甜适口，无涩味，无任何杂质和沉淀、悬浮物，且各项指标均符合国家标准的保健食品。活性试验表明，该饮料具有较强的体外抗氧化活性，且对便秘小鼠具有润肠通便的功效，并且其活性优于目前在售的2款同类酵素产品，具有广阔的市场应用前景。