牛病毒性腹泻防制

夏秀丽，姜 涛，李成波，冯 凯，任 锐，王 楠，邵洪泽*

1.榆树市农业综合执法大队，吉林榆树 130400；2.农安县农业综合执法大队，吉林农安 130200；3.农安县黄鱼圈乡综合服务中心，吉林农安 130200；4.吉林省畜牧兽医科学研究院 吉林长春 130062

牛病毒性腹泻是危害肉牛养殖的主要病毒传染病之一，国际兽疫局（OIE）将其定为B类传染病，农业农村部畜牧兽医局关于公开征求《一二三类动物疫病病种名录（修订征求意见稿）》拟将其列为二类动物疫病，受到管理部门和肉牛养殖场户日益重视。

1 流行状况

牛病毒性腹泻（BVD）又称黏膜病（MD），是由牛病毒性腹泻病毒（BVDV）引起的，临床症状与牛的肠炎等症状类似，通常表现为腹泻、发热、孕母畜流产等。该病最早发现于1946年的美国纽约，因与1953年发现的黏膜病病例为同一病原，1971年美国兽医协会命名为牛病毒性腹泻/粘膜病（BVD/MD）。目前，随着肉牛国际贸易流通，该病已在中国、日本、韩国、智利、巴西、加拿大、美国、德国等许多国家发生成为世界各地牛群中常见病之一，其传播速度较快，常呈地方性流行，给美国、加拿大等畜牧业发达国家带来了严重的经济损失。

2 病原

牛病毒性腹泻病毒（BVDV）为黄病毒科瘟病毒属成员。病毒直径约40～60 nm，有囊膜。根据观察培养细胞的变化，可将BVDV分成引起致细胞病变和非细胞病变的两种生物类型。从牛群中分离到的最常见生物型是非细胞病变型。根据病毒基因组5'非翻译区的差异，分为经典的BVDV分离株（BVDV1）和非典型BVDV分离株（BVDV2）两种基因型，现有研究认为可能是两个独立的种。细胞病变型产生于非细胞病变型，是基因重组的结果。细胞病变型毒株与相应的非细胞病变型毒株有明显不同，包括宿主RNA的利用及病毒NS2-3基因的复制，后者导致NS2-3的剪切及增加NS3表达量，可连续产生80000道尔顿的非结构蛋白（NS3），这是NS2-3基因产物发生剪切的结果。目前NS3的致病作用尚不清楚，但致细胞病变株引起的细胞损伤似乎是细胞凋亡的结果。病牛感染非细胞病变型病毒，可在其白细胞和其他组织中检测到NS3蛋白，这就解释了一些持续感染的动物免疫活性下降、发育不良及出现呼吸道症状的原因。细胞病变型毒株对肠道相关淋巴组织具有偏嗜性。病毒有4个结构蛋白，包括衣壳蛋白和Erns、E1、E2三种囊膜糖蛋白。其中，E2是病毒囊膜上糖蛋白，免疫原性强，可诱导机体产生中和抗体。

3 流行病学

病畜和隐性带毒者是该病的传染源，病毒通过发病动物分泌物和排泄物不断向外界扩散。牛、牦牛、鹿、羊等易感动物主要通过呼吸道及消化道感染，垂直传播也是传播途径之一。多数易感动物感染后症状不明显，其中犊牛易感性最高，症状相对明显，且发病率和病死率都较高。动物感染初期能在很短时间内排毒并将病毒传播给其它动物，持续感染的动物通过分泌物及排泄物排毒则是危害最严重的传染源。在东北地区，该病一般在春季和冬末较为高发，对于一些老疫区隐性感染率约在50%，且与新疫区相比急性病例较少。环境湿度大、饲养密度大、卫生条件差时易发病，常与其他病原菌或病毒继发或混合感染，易造成较大损失。

4 临床症状

根据临床表现可分为急性型和慢性型。急性型病例多见于犊牛。典型症状表现为腹泻，呈水样，粪带恶臭，有时稀便中含有黏液或血液，体温一般为39.2～42 ℃，可持续2～3 d。表现精神萎靡不振，口腔黏膜（唇内、齿龈或硬腭）和鼻黏膜糜烂或溃疡，病牛大量流涎。怀孕母牛发生流产或产畸形胎儿，新生犊牛体质弱易感染其他疾病。慢性型较少见，病程2～6个月，甚至1年。病畜间歇性腹泻伴随体温波动，粪便中可见带血或有黏膜。口腔、鼻镜黏膜糜烂，蹄部皮肤糜烂或坏死导致跛行。

5 病理变化

急性型发病牛在消化道如口腔（黏膜、齿龈、舌和硬腭）、咽部可见不规则溃疡或烂斑，个别牛在鼻镜处也有类似症状。病牛分泌脓性鼻汁，眼角膜呈现炎性水肿、出血。剖检可见小肠内壁变厚、肠腺出血坏死，淋巴结肿大。慢性型表现不明显，初期口腔黏膜炎症，少有糜烂，症状加重后出现溃疡、糜烂，逐渐和鼻镜连成一片。母牛产奶量下降，最终衰竭死亡。

6 诊断

根据病牛临床症状和剖检变化可以初步诊断。但在实际工作中，确诊则需进行实验室诊断。

6.1 病毒的分离鉴定

多种牛源单层细胞（如肾、肺、睾丸或鼻甲细胞）可用于分离病毒，两种生物型病毒皆可在细胞上生长良好。可通过电镜观察病毒粒子，也可通过分子生物学方法检测鉴定病毒，该方法是最传统方法，对仪器等要求比较高，周期较长。

6.2 酶联免疫吸附试验

酶联免疫吸附试验（ELISA）是一种依据抗原抗体的产生特异性反应原理建立的方法，是最常用的血清学检测方法，具有低成本、敏感性高、特异性强等特点。目前除了单纯用于检测抗原的ELISA方法外，检测BVDV抗体的检测方法也在临床上被广泛应用，并已有不少商品化试剂盒问世。刘勃兴等利用E.coli原核表达系统表达了Erns蛋白，以该蛋白为包被抗原，通过优化各反应条件，成功建立了间接ELISA方法。该方法操作简便，可实现在养殖场及屠宰场等基层的大批量检测，但耗时较长，且在具体检测过程中也应注意假阳性的出现。

6.3 聚合酶链式反应

PCR是一种在生物体外进行的DNA复制方法，该方法可大量扩增特定目的片段，是对病毒、细菌等病原体进行快速检测和鉴定的生物学方法。随着分子生物学技术的发展和新设备研发，衍生出的不同的分子生物学检测方法，不断提高病原检测的敏感性、特异性，逐步减少人员操作环节，提高自动化水平，操作更加简便快捷。

6.3.1 RT-PCR技术

该技术可用于诊断BVD病毒RNA，将病毒RNA反转录为cDNA后用特定引物将目标基因片段大量扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，将得到的结果放在紫外光下观察扩增条带是否与目的基因大小一致，从而对样品的阴阳性进行鉴定。陈姗等根据BVDV的保守序列设计了一对特异性引物，建立了一步法RT-PCR检测方法，该方法具有快速、灵敏、特异的优点，避免中间反转录操作环节的污染，减少假阳的出现。顾蓓蓓等建立套式PCR也用于该病毒的检测，原理是设计两对特异性引物，一对引物扩增片段中含有另外一对引物，该方法可明显提高检测灵敏度，为生物制品中检测BVDV污染提供了简单、快速的方法。而随着科研的进步，常规PCR逐渐被敏感性更高，更快速的实时荧光PCR代替。

6.3.2 RT-qPCR技术

实时荧光PCR是基于定性PCR技术基础上开发的新技术，目前常用的荧光定量PCR方法通常分为荧光染料法（SYB GreenⅠ）和荧光探针法（TaqMan荧光探针）两种。其原理都是将荧光基团加入到反应过程中，利用荧光PCR仪采集荧光信号，通过荧光信号的积累实时监测整个反应过程，最后通过标准曲线分析样品中病毒基因组的含量。该技术不仅可以实现对核酸模板的实时监测，而且具有灵敏度高、特异性强、可靠性强、自动化程度高等优点。

相较于荧光染料法而言，荧光探针法的特异性和敏感性更高，并且可以进行多重检测，是分子生物学诊断的常用方法。彭雪松等根据GenBank中BVDV的3种基因型5′端非翻译区（UTR）设计了2对特异性引物和3个探针，建立了BVDV基因分型三重实时荧光定量RT-PCR法。荧光探针法还可用于多种不同病毒的检测。如宋爽等建立可同时检测口蹄疫、牛病毒性腹泻和牛传染性鼻气管炎三种病原的方法。候佩莉等建立可同时检测牛病毒性腹泻病毒、牛冠状病毒和牛肠道病毒的方法。

6.3.3 逆转录-环介导增温技术

该方法与PCR原理相似，是通过识别靶序列的6～8个特异区域的引物和选择特殊功能的BstDNA聚合酶，可在恒温条件下完成目的基因的大量扩增，在反应体系中加入荧光染料，不需要PCR仪等仪器，在紫外灯下或者用肉眼就可以判定结果。段进刚等建立了针对BVDV Oregon C24V基因的RT-LAMP快速检测的方法，可方便、快速完成检测任务。

7 防制

病毒病没有有效的治疗药物，因此，疫苗接种是预防和控制牛病毒性腹泻最有效和经济的手段。现在市场上已有灭活疫苗可用，同时为了减少牛、羊的先天性缺陷，该病流行地区应在繁殖季节前用淘汰感染动物的方式消灭感染源。但由于BVD大多数是隐性持续感染和免疫耐受而没有严重的临床症状，并不受重视，因未能及时采取积极有效的防制措施而导致该病不断蔓延。陈锐等分析2014～2015年采集的内蒙、新疆、甘肃和云南四地散养牛血清样品，内蒙和新疆牛病毒性腹泻血清阳性率高达71.43%和57.69%，云南血清阳性率最低，也达到10%。王怀禹等在四川南充检测结果，牛病毒性腹泻血清阳性率18.53%。谢春芳等2014在上海也分离到牛病毒性腹泻病毒。上述研究表明，牛病毒性腹泻在我国的感染情况比较严重，已经成为威胁养牛业的主要疫病之一。因此，应通过严格引进检疫、坚持定期监测、加强饲养管理和环境消毒，并结合养殖场实际，制定科学的免疫程序，加强生物安全措施，实施由稳定控制到逐步净化的防制策略。