白头翁汤含药血清对口腔扁平苔藓上皮细胞增殖、凋亡及Fas/FasL信号通路的影响

李敏 王双双 高毅 杨梦华 张子建 冯艳红 李立芳

(河北省中医院口腔科,河北 石家庄 050011)

口腔扁平苔藓(OLP)属于慢性炎性口腔黏膜性疾病中的一种,临床有较高发病率〔1,2〕。OLP临床表现多样,主要为白色斑纹、充血及糜烂损害,其中充血、糜烂损害是患者出现疼痛等临床症状的主要病损类型〔3〕。由于此病病因复杂,目前仍缺乏有效的治疗手法,首选治疗为糖皮质激素药物治疗,但激素的治疗常伴随明显的副作用,且极易复发〔4〕。研究发现中药具有副作用小,能改善全身状况,可长期服用来维持疗效等优点。白头翁汤是由白头翁、黄连、黄柏、秦皮4味中药组成,可清热解毒、凉血止痢〔5〕,能促进非特异性免疫功能,具有抗炎、抗病毒、止泻、镇静镇痛、抑制肠运动的作用〔6〕,但其对OLP的作用机制还没有明确的报道。凋亡诱导配体(FasL)受体(Fas)、FasL均是肿瘤坏死因子家族成员,其可特异性地与Fas结合〔7〕。Fas广泛分布于不同类型的组织细胞,其在胞质和血清中有少部分可溶性,而FasL分布相对局限,除在活化的T细胞中有表达,还在一些免疫特殊部位有表达,例如眼睛、胎盘等。Fas/FasL可促进分泌炎症细胞因子,激发炎性反应,参与免疫豁免、免疫逃逸、肿瘤形成及转移等过程〔8,9〕。FasL还可以作为受体传递反向信号,促进细胞增殖,并参与一些自身免疫性疾病的发生。本文旨在研究白头翁含药血清对口腔扁平苔藓上皮细胞增殖、凋亡及Fas/FasL信号通路的影响。

1 材料与方法

1.1实验细胞和动物 人口腔黏膜角质形成细胞(HOK)购自美国Sciencell Research Laboratories公司。实验大鼠均从上海富莱生物科技有限公司购买,共计20只。雄性SD大鼠体质量为220～250 g,合格证号:SCXK(贵)2015-0005。在安静、适当室温、避光的环境下自由摄食饮水。实验动物符合伦理委员会规定。

1.2药物及制备 白头翁汤由白头翁15 g、黄连6 g、黄柏12 g、秦皮12 g组成,上述药材均购自新疆医科大学附属中医医院,经水煎、浓缩成1.0 g/ml浓度药液备用,制备工艺按照国家中医药管理局中药制剂管理规范实施操作,由河北省中医院制剂室完成。

1.3试剂和仪器 美国Sigma公司生产的脂多糖;德国Qiagen公司生产的Fas、FasL抗体;日本Olympus公司生产的显微镜;湖南湘仪实验室仪器开发有限公司生产的离心机;日本Nikon公司生产的DXM1200C型数码相机。

1.4含药血清的制备 将大鼠分为空白组和药物组,各10只。空白组给予1 ml生理盐水灌胃干预,2次/d,共3 d;药物组给予1.4 g/kg白头翁汤灌胃,每日两次,连续用药3 d;给药后大鼠均禁食8 h,于给药后第4天麻醉各组大鼠,取腹主动脉血于离心管中,离心15 min后收集血清并通过0.22 μm过滤器过滤,分装于离心管中,56 ℃水浴30 min灭活补体,-20 ℃保存备用。

1.5HOK细胞建立体外OLP炎症模型 HOK细胞培养于含10%胎牛血清(FBS)溶液、100 U/ml青霉素和链霉素的高糖DMEM培养基中,将培养基置于培养箱(37 ℃、5%CO2)中培养;消化并传代细胞,3 d传代1次,取3代细胞进行后续实验。将细胞密度调整为5×105ml,按照每孔1 ml的剂量分别加入6孔板内,继续培养24 h,弃掉培养基。取1 ml脂多糖,将其加入无血清的培养基中,充分振荡30 min使二者完全相溶,配制成1 mg/ml的脂多糖溶液,分装于EP管中。将细胞分为空白组(仅加入含10% FBS的DMEM培养基)和实验组(在DMEM培养至中加入10 μg/ml脂多糖培养HOK细胞)。

1.6白头翁含药血清干预 空白组培养细胞于含10%FBS溶液的培养基中,脂多糖组培养细胞于含10 μg/ml脂多糖+75 μl 10%空白血清的DMEM培养基中,低剂量组将细胞培养于含10 μg/ml脂多糖+75 μl 2.5%大鼠白头翁汤含药血清+75 μl 57.5%大鼠空白血清的培养基中,中剂量组将细胞培养于含10 μg/ml脂多糖+75 μl 5%大鼠白头翁汤含药血清+75 μl 5%大鼠空白血清的培养基中培养,高剂量组将细胞培养于含10 μg/ml脂多糖+150 μl 10%大鼠白头翁汤含药血清的培养基中培养,分别处理各组细胞6 h后检测细胞因子产物。

1.7酶联免疫吸附试验(ELISA)检测细胞分泌的白细胞介素(IL)-1β、IL-6和肿瘤坏死因子(TNF)-α表达 用离心管分别收集各组细胞培养基中的上清液,离心上清液后测定450 nm处的吸光度值,计算各个样本细胞因子的浓度。

1.8CCK-8检测HOK增殖 收集对数生长的HOK并接种于孔板内,在每孔中加入细胞悬液,再加入每组相应的药物(同1.6)。将孔板置入常规培养箱(37 ℃、5%CO2)中培养,分别孵育细胞48、72和96 h。将CCK-8溶液加入孔板内,继续培养细胞4 h。测定每孔在450 nm处的OD值。

1.9流式细胞仪检测HOK凋亡 将5×结合缓冲液稀释为1×结合缓冲液,将10 μl膜联蛋白(Annexin)Ⅴ和20 μl碘化丙啶(PI)加入后配制成Annexin Ⅴ/PI 染色工作液。将培养基弃掉后洗涤细胞,吸去磷酸盐缓冲液(PBS),每孔加入0.5 ml 0.25%胰酶,孵育细胞,弃掉胰酶,PBS洗涤后吹打细胞,制成细胞悬液并收集于离心管中,离心5 min后弃掉上清液,用200 μl Annexin Ⅴ/PI 染色液重悬细胞,轻轻吹打,避光孵育15 min,上机检测。

1.10Western印迹检测细胞中Fas、FasL蛋白表达 取各组细胞加入细胞蛋白裂解液0.5 ml均浆,在4 ℃环境下离心15 min,取上清液测量蛋白浓度;煮沸蛋白,电泳变性的蛋白样品转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,封闭1h后加入Fas和、FasL抗体;继续孵育24 h后加入1抗,暗室发光。

1.11RT-PCR检测细胞中Fas、FasL mRNA表达 取各组细胞,裂解后提取,合成cDNA,在仪器上检测Fas和FasL的表达情况。转录条件94 ℃ 5 min,94 ℃ 45 s,62 ℃ 45 s,72 ℃ 45 s,共35个循环。用2-ΔΔCt法进行计算相对表达量,引物序列:Fas正向:5′-TGAAAGCTTGACCTAGAGTG-3′,反向:5′-CAGG-GGCTAGGTACTTGA-3′;FasL正向:5′-TCTTTCCC-TCCATCAGCAC-3′,反向:5′-TCTTTCCCTCCATCAGCAC-3′;β-actin正向:5′-CTGGCATTGTCATGGAC-TCT-3′,反向5′-GCGATGATCTTGATCTTCAT-3′。

1.12统计学分析 采用SPSS19.0软件进行单因素方差、t检验。

2 结 果

2.1各组细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α表达比较 低、中、高剂量组和脂多糖组IL-1β、IL-6和TNF-α表达较空白组显著增加(P<0.05);与脂多糖组相比,低剂量组、中剂量组和高剂量组细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α表达均显著降低,且呈逐渐递减趋势(P<0.05);高剂量组细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α表达较低剂量组和中剂量组下降显著(P<0.05),见表1。

表1 各组细胞中IL-1β、IL-6和TNF-α表达比较

2.2各组HOK增殖比较 与空白组相比,脂多糖组48、72和96 h HOK细胞的增殖能力显著降低(P<0.05);与脂多糖相比,低、中和高剂量组HOK在48、72和96 h的增殖能力均显著升高(P<0.05);与低剂量组相比,中剂量组和高剂量组HOK的增殖能力显著增加(P<0.05);高剂量组HOK增殖能力较中剂量组回升明显(P<0.05),见表1。

2.3各组HOK凋亡能力比较 与空白组相比,低、中、高剂量组和脂多糖组HOK细胞凋亡率显著增加(P<0.05);低剂量组、中剂量组和高剂量组细胞凋亡率较脂多糖组均明显回降,且呈逐渐递减趋势(P<0.05),其中高剂量组细胞凋亡率回降的最为显著(P<0.05),见图1、表2。

图1 流式细胞仪检测HOK细胞凋亡

表2 各组细胞凋亡率和细胞中Fas、FasL蛋白及mRNA表达比较

2.4各组细胞Fas、FasL蛋白和mRNA表达 与空白组相比,低、中、高剂量组和脂多糖组细胞中Fas、FasL蛋白及mRNA表达显著增加(P<0.05);与脂多糖组相比较,低剂量组、中剂量组和高剂量组细胞中Fas、FasL蛋白及mRNA表达均显著降低(P<0.05);高剂量组细胞中Fas和FasL蛋白表达较中剂量组和低剂量组回降的较为显著(P<0.05),见表2、图2。

图2 各组细胞中Fas和FasL蛋白表达比较

3 讨 论

OLP主要的组织病理学表现是皮下T细胞为主的淋巴细胞带状浸润、基底角质形成细胞液化变性及基底膜角化过度或角质层萎缩〔10〕。OLP细胞损伤的主要因素是损伤部位出现免疫和炎症反应,其中上皮细胞凋亡被认为是OLP中组织损伤的重要机制〔11〕。活化的毒性T细胞诱导的基底角质形成细胞凋亡,是OLP重要的组织病理学特征,即基底膜空泡变性。

研究证实,在OLP患者的唾液及口腔分泌物中发现核转录因子(NF)-κB及相关细胞因子均呈高表达,例如IL-1β、IL-6和TNF-α等,这提示 NF-κB的激活及其相关细胞因子的分泌在导致OLP炎性反应、促进病程发展过程中起到了重要作用〔12,13〕。有研究〔14〕发现TNF-α参与OLP的发病机制,TNF-α通过激活NF-κB增加OLP的炎性反应,造成局部炎性反应慢性迁延不愈,同时,被炎性因子活化的上皮角质形成细胞本身也会产生TNF-α等炎性因子,这些因子协同作用,最终导致了OLP病损区域以细胞凋亡及炎性反应为代表的慢性组织损伤。本研究结果提示,白头翁含药血清对OLP细胞分泌的炎性因子有抑制作用。白头翁汤方中白头翁对凉血止痢有显著疗效;秦皮味苦,对凉肝益肾有显著疗效;黄连对凉心清肝有显著疗效;黄柏对泻火补水有显著疗效〔15,16〕。

机体维持稳态的基本条件是细胞增生与凋亡之间的平衡,而这种平衡一旦被破坏就会引起疾病〔17〕。研究表明,OLP上皮细胞增殖、修复、凋亡异常,其中增殖和凋亡异常在OLP损害发生中有重要作用。本研究结果提示白头翁含药血清可促进OLP上皮细胞的增殖,抑制细胞凋亡。张婷婷等〔18〕研究证实,与正常对照组凋亡指数相比,模型组细胞凋亡指数升高,其表达率为85.7%,提示口腔扁平苔藓的发生或进展可能与上皮细胞凋亡的异常有关。Fas-FasL途径是细胞毒性T细胞引起靶细胞凋亡的主要途径,与OLP的细胞凋亡有密切关系〔19〕。本研究结果显示,体外培养的OLP细胞中Fas和FasL表达显著增加,不同浓度的白头翁含药血清干预后细胞中Fas和FasL表达显著降低,且浓度越高蛋白表达降低越为显著。有研究证实〔20〕,在OLP患者中发现Fas/FasL及颗粒酶B与口腔黏膜角质形成细胞凋亡相关,且FasL及颗粒酶B的高表达与OLP病情发展有密切关系。

综上,白头翁含药血清可调节口腔扁平藓上皮细胞的生物学活性,促进口腔黏膜角质形成细胞增殖,抑制其凋亡,降低炎性水平,其作用机制可能与调控Fas、FasL蛋白有一定相关性。