中药千金子二萜醇对肾癌786-0细胞移植瘤S期激酶相关蛋白2的影响

龚永明 周磊 宋圣佑 赵俊峰

(1河南省中医院 河南中医药大学第二附属医院泌尿外科,河南 郑州 450002;2河南中医药大学第二临床医学院)

肾细胞癌起源于肾小管上皮细胞,简称肾癌,在泌尿系统中仅次于膀胱癌和前列腺癌,是泌尿系统中致死率最高的恶性肿瘤。肾癌的发病原因及其发生发展的生物学机制仍不明确,有研究发现S期激酶相关蛋白(Skp)2对肾细胞癌的形成有一定影响,同时也有研究发现中药千金子二萜醇可抑制肾脏癌细胞的增殖、侵袭和转移。本研究旨在探讨中药千金子二萜醇对肾癌786-0细胞移植瘤Skp2的影响。

1 材料和方法

1.1材料与试剂 千金子二萜醇(四川维克奇生物科技有限公司);肾癌786-0细胞由(武汉普诺赛生命科学有限公司);4～8周龄的SPF级BALB/c裸鼠(北京斯贝福生物技术有限公司),16只(雌雄各半),体质量16～21 g;0.25%胰蛋白酶(北京索莱宝科技有限公司);10%胎牛血清及RPMI1640培养基(美国GIBCO公司);鼠抗人Skp2mAb、免疫组化(SP)试剂盒及二氨基联苯胺(DAB)显色剂(中杉金桥生物技术有限公司)。

1.2786-0细胞培养 将培养基中的786-0细胞在恒温条件下完全培养到90%饱和,取生长状态良好的细胞,首先用胰蛋白酶(浓度为0.25%)进行消化,然后再用胎牛血清培养液(浓度为10%)配成一定浓度的细胞悬液(细胞浓度为1×107个/ml)。

1.3构建移植瘤动物模型及分组 将配好的786-0细胞悬液(0.2 ml/只)分别皮下注射于每只裸鼠右前肢腋窝处,然后随机分成两组:对照组和实验组,每组8只。

1.4监测移植瘤生长情况 自肿瘤细胞注射1 w起,瘤体生成后每天观察成瘤情况,待瘤体生长无明显差异后开始给予药物干预。对照组移植瘤裸鼠给予等体积的生理盐水灌胃,实验组移植瘤裸鼠给予20 mg/kg千金子二萜醇溶液灌胃。药物开始干预后每3 d用毫米游标卡尺分别测量瘤体的长、宽、高最大直径(mm),依据肿瘤体积(V)计算公式:V(mm3)=长×宽×高/2,算出瘤体大小。在用药21 d后处死裸鼠,切取瘤体组织备用。

1.5制作瘤体组织蜡块及SP检测 切取大小约1.0 cm×1.0 cm×0.5 cm的瘤体组织,均用浓度为10%甲醛固定,常规脱水及石蜡包埋后,对所有标本组织蜡块常规切片,厚度4～5 μm,每张切片用DAB溶液显色,蒸馏水终止反应,苏木素-伊红(HE)染色,然后作形态学观察。SP染色法严格按SP试剂盒说明书仔细操作,选择有代表性的肿瘤区域及进行标记。用已知乳腺癌标本作阳性对照,用等渗缓冲盐溶液(TBS)代替一抗作阴性对照。

1.6结果判定制定判定标准 Skp2在胞核胞质中或只在胞核中表达为阳性,仅在胞质中表达为阴性。随机取5个高倍视野,然后计算每个高倍视野下阳性细胞数占总肿瘤细胞数的比率,最后再计算此5个高倍视野的平均百分比。Skp2阳性细胞数<10%为阴性,≥10%为阳性,结果判定由2人一起完成,取两人测得平均数。

1.7统计学分析 采用SPSS26.0软件进行χ2检验。

2 结 果

裸鼠移植成瘤后灌药21 d,处死裸鼠,将裸鼠瘤体组织剥离下来,然后用SP法检测裸鼠瘤体组织Skp2表达,Skp2主要表达在细胞核中,也有部分表达在胞核胞质中。阳性染色呈现粗大棕黄色颗粒,见图1。Skp2在对照组和实验组的裸鼠瘤体中表达率分别为87.50%(7/8)和12.50%(1/8),两组差异显著(χ2=0.12,P=0.04)。

图1 两组瘤体组织Skp2表达(DAB,×200)

3 讨 论

肾癌是泌尿系常见的恶性肿瘤之一,占肾肿瘤的85%以上〔1〕,占所有恶性肿瘤的2%。在大多数国家和地区,肾癌的发病率呈持续增长的趋势〔2〕,每年约14万人死于该病〔3〕,严重威胁人类的生命健康。肾癌的发病原因尚不明确,有研究发现肾癌的发病与家族遗传、肥胖、职业、抽烟、饮食、糖尿病、高血压、放射等多种因素有关,主要表现为血尿、腰部疼痛、腰部肿物等不适。肾癌的治疗首选根治性肾切除术,由于肾癌对放疗和化疗均不敏感,因此不能作为常规的辅助疗法。同时有研究发现,20%的肾癌患者首次就诊时已经出现远处转移,这些患者需要新的辅助治疗。近年来,随着医学的进步,发现了许多治疗肾癌的新方法,比如免疫治疗、靶向治疗,为肾癌的治疗带来了新希望,但大部分患者在接受治疗过程中由于获得性耐药而导致疗效欠佳,进而成为进展性疾病〔4〕,导致有效的治疗率仍较低〔5〕,再加免疫治疗及靶向治疗价格昂贵,仍不能普及应用,因此仍有待于积极寻找更新、更多样化的治疗方法。

研究发现,Skp2是叉头盒(Fox)蛋白质家族成员,它与Skp1、Cullin和Rbx1共同构成,基因定位于人5号染色体短臂上(5p13),是一种泛素-蛋白连接酶复合物,是一个致癌基因,它调控着许多重要的生物学过程来促进肿瘤的发生、发展。研究发现,Skp2通过影响E钙黏蛋白、周期蛋白激酶抑制因子(CKIs)、FOXM1、p57、基质金属蛋白酶9蛋白表达水平等调节细胞的周期进程,影响细胞的凋亡和DNA的损伤,并可促进肿瘤细胞的糖酵解及调节肿瘤干细胞的分化等,进而影响肿瘤的发生、转移和复发等〔6,7〕,已有研究报道Skp2在乳腺癌、淋巴瘤、前列腺癌等许多恶性肿瘤中高表达。Skp2高表达与肿瘤进展和预后不良正相关,在肾脏多种类型的恶性肿瘤中,如肾脏嫌色细胞癌、肾脏透明细胞癌和肾脏乳头状细胞癌,Skp2高表达者的生存期较低表达者明显缩短,因此Skp2的高表达是肾癌预后欠佳的重要因素〔8〕。多种研究发现,Skp2与肿瘤的发生、发展和预后有紧密联系,在多种恶性肿瘤中高表达,根据此特性,抑制Skp2表达成为治疗恶性肿瘤的新方法之一〔9,10〕。

实验研究发现,千金子可抑制多种恶性肿瘤的发生、发展〔11〕,已有报道千金子对白血病、食管癌、鼻咽癌等的治疗均有很好的效果。千金子别名又叫千两金、续随子等,为大戟科植物,性温,味辛,毒性小,主要含有大量脂肪油、二萜醇、香豆素等化合物,其中二萜醇类化合物是其主要成分,也是其重要的活性成分,主要用于内治水肿、痰饮、积滞胀满、二便不通、血瘀经闭等,外治顽癣、疣赘。赵俊峰等〔12〕研究发现,千金子二萜醇可在体外抑制肾癌Renca细胞和人肾癌786-0细胞的增殖,促进肾癌Renca细胞的凋亡,并可抑制肾癌细胞的侵袭和迁移。

有研究发现,姜黄素在一定程度上能抑制结肠癌SW480细胞中Skp2的表达,通过调控Skp2-p27kip通路可能是其抑制结肠癌细胞增殖并促进其凋亡的分子机制之一〔13〕。丁虹等〔14〕研究发现,半枝莲提取物能够显著诱导信号传导转录激活因子(STAT)3信号的活化,降低Skp2表达,使肿瘤细胞在G0/G1期受阻,从而抑制肿瘤细胞的增殖,此研究结论为鼻咽癌的治疗提供了新的思路与方向。

综上,中药千金子二萜醇能抑制786-0细胞移植瘤Skp2的表达,从而得出千金子二萜醇可通过另外一条机制起到治疗肾细胞癌的作用。但目前的研究还停留在动物模型阶段,对于临床的应用效果及对不同类型的恶性肿瘤是否具有同样的治疗作用还需要进一步探索。