白藜芦醇脂质体对人肺腺癌A549细胞增殖和凋亡的影响

赵娟 张京京 武雨晴 张迪 宗雅迪 雷宇华 耿丽娜

(河北医科大学 1教学实验中心,河北 石家庄 050017;2基础医学院;3河北师范大学化学与材料科学学院)

肺癌在2020年中国癌症新发病例数和死亡例数中均居于首位〔1〕。肺癌已经成为严重威胁我国国民生命健康的公众卫生问题。白藜芦醇(RES)作为纯天然化合物其具有多种生物活性,如抗炎、抗癌、抗氧化及改善心血管功能等作用〔2～5〕。研究证明,RES可用于治疗肝癌、前列腺癌、乳腺癌、肺癌等肿瘤〔6,7〕。但RES化学性质不稳定,进入人体后易被氧化,且存在水溶性差、口服吸收性差、难以持久作用等缺点,导致生物利用率下降〔8〕。脂质体(LIP)作为药物载体材料,其结构类似细胞生物膜,具有可溶性好,化学性质稳定,促进所携带药物吸收等优点〔9,10〕。采用纳米LIP对RES进行包封和载运,可延缓药物释放、缓解药物的毒性、增强药物稳定性,提高疗效〔11,12〕。本研究RES-LIP对A549细胞增殖及凋亡的影响。

1 材料和方法

1.1材料与试剂 RES(纯度>98%)购自上海源叶生物科技有限公司;大豆卵磷脂(纯度>75%)购自北京源华美磷脂科技有限公司;胆固醇(纯度>95%)购自上海源叶生物科技有限公司;RPMI1640培养基、胎牛血清(FBS)购自美国Gibco公司;胰蛋白酶、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)购自北京华美公司;4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)、罗丹明123购自北京索莱宝科技有限公司;膜联蛋白Ⅴ-异硫氰酸荧光素/碘化丙啶(Annexin Ⅴ-FITC/PI)凋亡检测试剂购自美国BD公司。A549细胞购自北京协和细胞库。

1.2主要仪器与设备 RE-2000旋转蒸发仪购自上海亚荣生化仪器厂;CPS2超声波粉碎机购自宁波新芝超声有限公司;CO2培养箱购自美国Thermo公司;倒置荧光显微镜(IX71)购自日本Olympus公司;ELX900型酶标仪购自美国Bio-Tek公司;流式细胞仪购自美国BD公司。

1.3RES-LIP的制备 采用薄膜旋转蒸发-超声法制备纳米RES-LIP混悬液。膜材比按卵磷脂和胆固醇质量比=10∶1,药脂比按RES与卵磷脂质量比=1∶40制备。用无水乙醇将其完全溶解后转移至圆底烧瓶,45 ℃缓慢旋转成膜。磷酸盐缓冲液(PBS)水化洗膜得到RES-LIP混悬液,水浴超声后避光透析,所得产物RES-LIP于电镜拍照,于4 ℃密封保存备用〔13〕。

1.4细胞培养与分组 A549细胞培养采用RPMI1640培养基,含10% FBS、青霉素100 U/ml、链霉素100 μg/ml,置于37 ℃、5% CO2、饱和湿度培养箱中培养,每天倒置显微镜观察细胞生长状态,待细胞生长至80%融合时,用0.25%胰蛋白酶消化传代。将细胞分为:对照组、LIP组、RES组和RES-LIP组。

1.5MTT法检测细胞增殖活性 取对数生长期细胞,制成1×105/ml的细胞悬液接种于96孔板中,每组6个平行孔,每孔加100 μl细胞悬液。置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱内常规培养。第2天弃去完全培养基,加入用无血清的基本培养基稀释的LIP、RES和RES-LIP 100 μl,终浓度均为0、5、10、20、40 μg/ml。培养24 h后,每孔加20 μl 5 mg/ml的MTT,再放入培养箱放置4 h,倒掉上清,向每个孔加入150 μl DMSO,震荡10 min使其混合均匀,用酶标仪在490 nm波长处测定各孔光吸收值(OD值)。细胞增殖率以各处理组与对照组OD值之比的百分率表示。

1.6细胞形态学观察 将对数生长期的A549细胞按1×105/ml浓度接种于24孔板中,每孔400 μl,于培养箱中培养至细胞生长融合率到80%时,弃去原液,分4组加药:对照组、LIP组、RES组和RES-LIP组,其中RES组和RES-LIP组RES含量均为10 μg/ml,对照组是等体积的基本培养基,LIP组是等体积的LIP。常规培养24 h,用PBS洗涤,于倒置显微镜下观察拍照。拍照之后加入4%多聚甲醛室温固定细胞30 min,弃固定液,用PBS洗3次,加入DAPI(5 μg/ml)避光孵育5 min。弃荧光染液,PBS洗3次,倒置荧光显微镜下观察细胞核的形态变化。

1.7流式细胞术分析细胞凋亡 实验采用Annexin Ⅴ-FITC/PI 双染法检测细胞凋亡,流式细胞仪定量分析。取对数生长期细胞A549,将1×105/ml的细胞悬液接种于细胞瓶中,置于CO2培养箱中常规培养。按上述1.4分组加药处理细胞24 h,弃去原液,消化离心,分别用PBS和1 ml 1×缓冲液洗涤两次后,加1×Annexin Ⅴ结合液400 μl并吹打细胞成悬浮液,其终浓度大约为1×106/ml,再向其加Annexin Ⅴ-FITC染色液5 μl,混匀后在避光室温放置15 min,然后加PI染色液10 μl,避光孵育5 min,最后用流式细胞仪检测。绘制直方图并计算出早期和晚期细胞凋亡率。

1.8线粒体膜电位(MMP)检测 取对数生长期细胞,制成1×105/ml的细胞悬液接种于细胞瓶中,置于CO2恒温培养箱中常规培养。按1.4分组加药处理细胞24 h。弃培养基,消化离心,PBS洗涤后,用0.5 ml的PBS重悬A549细胞,再加入10 μg/ml的罗丹明123染色液,常温避光处理15 min后,用流式细胞仪检测并计算MMP值。MMP = log(X-Mode)× 340。

1.9统计学处理 采用SPSS16.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1RES-LIP制备模式 采用薄膜旋蒸-超声法,制备了粒径约100 nm,包封率约为90%的RES-LIP,相关药物粒径、电位等表征参阅已发表的论文〔13〕。制备模式和电镜如图1所示。

图1 RES-LIP制备模式(A)和电镜(B,×120 000)

2.2RES-LIP对A549细胞增殖的影响 LIP组的细胞增殖活性与对照组相比,无统计学差异(P>0.05),说明采用天然大豆卵磷脂和胆固醇制备的LIP无毒性,不影响A549细胞的增殖活性。相反,RES和RES-LIP两组结果显示,A549细胞增殖活性随着药物浓度的增加而降低(P<0.05),其中20～40 μg/ml的RES和RES-LIP可极显著抑制A549细胞增殖(P<0.01);与RES组相比,10～40 μg/ml的RES-LIP组均增加了对A549细胞的毒性,显著抑制了细胞增殖(P<0.05)。见表1。

表1 LIP、RES及RES-LIP对A549细胞增殖的影响

细胞形态学观察显示,对照组与LIP组的A549细胞呈梭形或多边形,排列紧密,形态饱满,细胞核大。而RES组和RES-LIP组细胞增殖活性受到抑制,细胞数量明显下降,细胞排布稀疏,部分细胞失去原有正常形态,细胞轮廓模糊,变圆并脱落。RES-LIP组细胞发生上述形态变化比RES组更显著。见图2。

图2 RES-LIP对A549细胞形态的影响(×40)

2.3RES-LIP对A549细胞凋亡的影响 对照组和LIP组细胞核形态正常,呈现圆形或者椭圆形,细胞核界限比较清晰,蓝色荧光染色比较均匀。与对照组相比,RES组和RES-LIP组细胞核出现了不同程度的核固缩和碎裂,呈现出典型的凋亡细胞特点。RES-LIP组细胞的细胞核变化程度高于RES组。见图3。

图3 RES-LIP对A549细胞核形态的影响(DAPI染色,×40)

实验进一步采用Annexin V-FITC/PI双染的方法,用流式细胞仪定量分析了RES-LIP诱导A549细胞凋亡的情况。结果显示,RES组和RES-LIP组早凋亡与晚凋亡的细胞比例明显高于对照组(P<0.05),且RES组早凋亡与晚凋亡率明显小于RES-LIP组(P<0.05)。见图4、表2。

表2 LIP、RES及RES-LIP对A549细胞凋亡的影响

图4 Annexin Ⅴ-FITC/PI 染色检测A549细胞凋亡

2.4各组MMP比较 对照组MMP(910.60±8.91)和LIP组(903.98±10.91)无统计学差异(P>0.05);而RES组(581.15±7.26)和RES-LIP组MMP(562.03±6.76)较对照组明显下降(P<0.01),且RES-LIP组MMP下降水平明显大于RES组(P<0.05)。

3 讨 论

作为天然生物活性的抗肿瘤药物,RES提取方便,生物活性强,副作用小,但其溶解度较低,且易在体内水解,从而降低其生物效能,限制了其在医学上的应用〔14〕。近些年出现的药物载体LIP具有良好的脂溶性、稳定性高及缓释性等优点,提高了药物生物利用率〔15～17〕。本研究结果采用天然大豆卵磷脂和胆固醇制备的脂质体,生物相容性更好,无毒性;同时制备了药物包载率高且粒径小的新型RES-LIP。RES对A549细胞的毒性作用主要表现在抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,细胞增殖受抑制与凋亡直接体现在细胞数量和形态的改变。MTT细胞增殖和细胞形态学观察结果提示,RES-LIP对A549细胞增殖抑制作用比RES组更显著;DAPI荧光检测和流式细胞分析凋亡情况提示,RES和RES-LIP可以诱导A549细胞凋亡,且 RES-LIP组比RES组凋亡更显著。MMP的稳定有助于维持线粒体的功能,进而维持细胞的生物活性〔18〕。MMP下降是细胞凋亡中最先发生的生物学事件,它标志着不可逆的进行性凋亡的开始〔19〕。本研究结果表明,RES-LIP可以通过线粒体途径促进细胞凋亡。

长期以来被用于传递药物,其基础是LIP膜与细胞膜融合或LIP被细胞内吞,然后将其内容物释放到细胞质中〔20,21〕。研究发现,RES-LIP释放完全所需时间为等量RES的13倍,证实了纳米RES-LIP的缓释性〔22〕。相比于游离的RES,相同时间内RES-LIP由于载体缓慢释放药物,避免了细胞短期内与大量RES 接触,从而增强了RES的生物作用〔12〕。由于RES-LIP的胞吞作用吸收速度慢于游离药物,由载体缓慢释放药物引起的细胞吸收速度慢,从而避免了细胞内瞬时产生大量的浓度,最终起到了延缓药物释放,增加药物的作用时间。