AMF对盐胁迫下桢楠生长和生理特性的影响

王介华，睢金凯，崔令军，石开明

（1.湖北民族大学 生物资源保护与利用湖北省重点实验室，湖北 恩施 445000；2.河北科技师范学院 海洋资源与环境学院，河北 秦皇岛 066000）

盐胁迫是自然界主要的非生物胁迫之一，盐胁迫对植物的影响主要包括植物生长、矿质元素吸收和代谢生理等方面。研究发现盐胁迫下植株体内矿质元素含量减少，生物量降低，导致植株减产和质量下降[1]。目前应用接种丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）来提高植物对盐碱耐受性的方法日益受到农林学家广泛关注，AMF 可以与地球上约80%的植物根系建立共生关系并形成丛枝菌根[2]，能够促进宿主植物对土壤中大量元素磷、钾和微量元素锌、铜等的吸收[3]，从而增加生物量；同时AMF 可以促进植株体内的渗透调节，提高可溶性蛋白、可溶性糖和Pro 的含量，增加超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶的活性[4-5]，从而能够减轻植物受到外界环境胁迫时的不利影响，提高植物的抗逆能力。

桢楠（PhoebezhennanS.Lee & F.N.Wei）为樟科Rosaceae 楠属PhoebeNees常绿大乔木，是亚热带常绿落叶阔叶林的重要组成树种，由于气候变化和自然灾害等因素的影响，目前楠木资源较为缺乏，现存林分主要生长在我国的四川、贵州、湖北、湖南和浙江等省份[6]。前期研究发现AMF在高盐浓度下（300 mmol·L-1）对桢楠根系具有较高的侵染率（41.25%），且AMF 能够显著地促进桢楠根系生长[7]。因此，本试验以桢楠为材料，探讨丛枝菌根真菌在改善桢楠耐盐性方面的作用，旨在促进桢楠在盐碱环境中的生长，提高桢楠的抗盐能力，为拓宽楠木的种植范围和盐碱地区发展楠木产业及其他树种造林提供科学依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

以桢楠为试验材料，2017 年11 月上旬于湖北省恩施土家族苗族自治州林业科学研究院（109°29＇58″E，30°17’51″N）采集种子，室温下阴干后调制，置于冰箱中4 ℃下保存。所用AMF 菌种为Funneliformismosseae，购于中国丛枝菌根真菌种质资源库，并以三叶草Trifoliumrepens为寄主植株进行扩繁；接种菌剂包含AMF 侵染的三叶草根段及真菌孢子，每个真菌接种处理接种120 g菌剂（约1 500 个孢子）。

1.2 试验设计

2018 年3 月，将种子取出后用10%的碳酸氢钠溶液浸泡48 h，然后搓洗去除种子表面包被的油脂，经70%的酒精消毒后用蒸馏水清洗干净，置于灭菌（0.11 MPa，121 ℃，1 h）的河沙中催芽。将催芽的种子置于人工气候箱内，昼夜温度分别设置为25 ℃和18 ℃，相对湿度80%，光照时间16 h，黑暗时间8 h。选取高度一致、具有4 片真叶的无菌桢楠幼苗移栽到塑料盆中（苗高20 cm左右），加入1.5 kg 消毒（0.11 MPa，121 ℃，1 h）基质（土壤∶沙=1∶1，V/V）。试验于8 月中旬进行，设AMF 接种（+AMF）处理和未接种（-AMF）2组处理，每个处理种植10 盆，每盆3 株幼苗。接种菌剂包含AMF 真菌侵染的三叶草根段及AMF真菌孢子，未接种处理在塑料盆中填充相同质量的灭菌物质以保持微生物区系一致。NaCl 处理为100、200 和300 mmol·L-1，以蒸馏水为对照（CK），隔3 d 浇1 次盐水，每次各浇100 mL，钵下放盘，为保持盆内盐浓度，如有渗漏，将渗出液反倒回去，盐胁迫30 d 后进行相应指标的测定。

1.3 试验方法

1.3.1 生长指标测定

植株高度和地径用游标卡尺测量。采集正常生长的完整植株，然后分离每株的地下部分（根）和地上部分（茎叶）并用去离子水清洗，用吸水纸吸干表面水分，记录鲜质量，然后将植株的根、茎、叶放置在烘箱中70 ℃下烘干至恒质量后测定干物质质量，每个处理测定5 次。

1.3.2 矿质元素含量测定

N 元素含量采用AA3 连续流动分析仪测定；P 元素含量采用钼锑抗比色法测定；Ca、Mg、Fe、Mn、Cu、Zn、K 和Na 元素含量采用Optimal 2100 DV 电感耦合等离子发射光谱仪（美国Pekin-Elmer 公司）测定[8]，每个处理测定5 次。

1.3.3 生理指标测定

采用考马斯亮蓝G—250 法测定可溶性蛋白含量，蒽酮比色法测定可溶性糖含量，酸性茚三酮比色法测定脯氨酸（Pro）含量，硫代巴比妥酸法测定丙二醛（MDA）含量，氮蓝四唑（NBT）光化还原法测定超氧化物歧化酶（SOD）活性，愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性，紫外吸收法测定过氧化氢酶（CAT）活性，分光光度计法测定抗坏血酸过氧化物酶（APX）活性[8]，每个处理测定5 次。

1.4 数据分析

采用Excel 2003 和SPSS 22.0 软件进行数据处理及统计分析，用Two-way ANOVA 与S-N-K 检验分析各处理间差异的显著性。

2 结果与分析

2.1 盐胁迫下AMF 对桢楠生长的影响

由表1 可以看出，在不同浓度NaCl 胁迫下，AMF 显著提高了桢楠的株高、基径、地上部干物质质量和根系干物质质量，AMF 接种与未接种桢楠的株高、基径和根系干物质质量均呈显著差异（P＜0.05）。在NaCl 浓度为100 mmol·L-1时，AMF 接种比未接种桢楠的株高增加了20.26%，基径增加了24.12%，地上部干物质质量增加了10.11%，根系干物质质量增加28.81%。双因素方差分析结果显示，AMF 对株高、基径和根干物质质量有显著影响，盐胁迫对地上部干物质质量有显著影响。

表1 盐胁迫和AMF 处理对桢楠生长指标的影响†Table 1 Combinative effects of AMF and salt stress on the plant growth index of P. zhennan

2.2 盐胁迫下AMF 对桢楠大量元素含量的影响

由图1 可以看出，在NaCl 浓度为100、200 和300 mmol·L-1时，AMF 接种比未接种桢楠的N 含量分别减少了4.89%、2.34%和7.34%，但差异均不显著。在NaCl 浓度为100 mmol·L-1时，AMF接种比未接种桢楠的P 含量增加了2.85%，Mg 含量增加了16.24%。双因素方差分析结果显示，AMF、盐胁迫对Ca 含量影响显著，AMF 与盐胁迫的交互作用对Mg 含量的影响均为显著。

2.3 盐胁迫下AMF 对桢楠微量元素含量的影响

由图2 可以看出，在NaCl 浓度为300 mmol·L-1时，AMF 接种比未接种桢楠的Fe 含量增加了3.60%，Mn 含量增加了16.39%；在NaCl 浓度为100 mmol·L-1时，AMF 接种比未接种桢楠的Cu 含量增加了8.12%，Zn 含量增加了19.40%。双因素方差分析结果表明，AMF 对Zn 含量的影响均为显著，AMF 与盐胁迫的交互作用对Cu 和Zn 含量的影响均为显著。

图2 盐胁迫和AMF 处理对桢楠微量元素含量的影响Fig.2 Combinative effects of AMF and salt stress on the micronutrient concentrations of P. zhennan

2.4 盐胁迫下AMF 对桢楠K、Na 含量及K/Na的影响

由图3 可以看出，在NaCl 浓度为100、200 和300 mmol·L-1时，AMF 接种比未接种桢楠的K 含量分别增加了22.11%、11.36%和7.19%，Na 含量减少了28.38%、25.13%和49.68%，K/Na 增加了64.82%、41.17%和61.28%，且均呈显著性差异（P＜0.05）。双因素方差分析结果显示，盐胁迫对K 含量的影响显著，AMF 对K/Na 的影响显著，AMF与盐胁迫的交互作用对Na 含量的影响显著。

图3 盐胁迫和AMF 处理对桢楠K、Na 元素含量及K/Na 的影响Fig.3 Combinative effects of AMF and salt stress on the concentrations of K and Na as well as K/Na ratios of P. zhennan

2.5 盐胁迫下AMF 对桢楠渗透调节物质的影响

由图4A 可以看出，在NaCl 浓度为100、200和300 mmol·L-1时，AMF 接种比未接种桢楠的Pro 含量分别增加了28.34%、39.37%和57.82%。双因素方差分析结果表明AMF 对Pro 含量有显著影响，盐胁迫对Pro 含量无显著影响（表2）。

图4 盐胁迫和AMF 处理对桢楠渗透调节物质的影响Fig.4 Combinative effects of AMF and salt stress on osmotic adjustment substances of P. zhennan

表2 接种AMF、盐胁迫和二者交互作用对桢楠生长及生理指标的影响†Table 2 ANOVA for the combinative effects of AMF and salt stress on the growth and physiological indicators of P. zhennan

由图4B 可以看出，在NaCl 浓度为100、200 和300 mmol·L-1时，AMF 接种比未接种桢楠的可溶性糖含量分别增加了21.32%、48.82%和55.13%。双因素方差分析结果显示，AMF 和盐胁迫对可溶性糖含量有显著影响（表2）。

由图4C 可以看出，在NaCl 浓度为100、200和300 mmol·L-1时，AMF 接种比未接种桢楠的可溶性蛋白含量分别增加了12.02%、16.07%和20.74%。双因素方差分析结果表明，AMF 对可溶性蛋白含量有极显著影响，盐胁迫对可溶性蛋白有显著影响（表2）。

由图4D 可以看出，在NaCl 浓度为100、200和300 mmol·L-1时，AMF 接种比未接种桢楠的MDA 含量分别降低了12.43%、20.23%和3.54%。双因素方差分析结果显示，AMF 对MDA 含量有极显著影响，盐胁迫及对MDA含量无显著影响（表2）。

2.6 盐胁迫下AMF 对桢楠抗氧化酶活性的影响

由图5A 可以看出，在NaCl 浓度为100、200和300 mmol·L-1时，AMF 接种比未接种桢楠的SOD 活性分别增加了16.03%、16.74%和10.59%。双因素方差分析结果显示，AMF 对SOD 活性有显著影响，盐胁迫SOD 活性无显著影响（表2）。

图5 盐胁迫和AMF 处理对桢楠抗氧化酶活性的影响Fig.5 Combinative effects of AMF and salt stress on the antioxidant enzyme activity of P. zhennan

由图5B 可以看出，在NaCl 浓度为100、200和300 mmol·L-1时，AMF 接种比未接种桢楠的POD 活性分别增加了44.16%、37.88%和34.41%。双因素方差分析结果表明，AMF 对POD 活性有显著影响，盐胁迫对POD 活性无显著影响（表2）。

由图5C 可以看出，在NaCl 浓度为100、200 和300 mmol·L-1时，AMF 接种比未接种桢楠的CAT 活性分别增加了40.82%、42.11% 和30.25%。双因素方差分析结果显示，AMF、盐胁迫对CAT 活性无显著影响（表2）。

由图5D 可以看出，在NaCl 浓度为100、200和300 mmol·L-1时，AMF 接种比未接种桢楠的APX 活性分别增加了26.37%、24.11%和1.45%。双因素方差分析结果显示，盐胁迫对APX 活性有显著影响，AMF 对APX 活性无显著影响（表2）。

3 结论与讨论

盐害对植物最直接的影响就是降低生物量的积累，因此生长量是植物耐盐性评价的直接指标[9-10]。土壤中高浓度的NaCl 不仅会引起植物体内Na 和Cl 元素的过量积累，还会影响土壤中其他营养元素的活性，导致植物细胞处于营养亏缺的状态中。对小麦和大麦[10]耐盐性和柱子草[12]耐盐生理的研究表明，盐胁迫可导致叶片变小、干质量降低和生长量减弱等不良影响；而接种菌根真菌可以缓解盐害对植物的危害，促进盐胁迫下生物量的积累[13]。本试验结果表明，在同等盐浓度胁迫下，接种AMF 的生长与生物量均显著高于未接种，表明AMF 能够显著减缓盐胁迫对桢楠生长的影响，这与对红花[14]、核桃[15]、黑松[16]的研究结果一致。

土壤盐渍化导致植株细胞内积累了大量的Na+，使植株产生离子毒害并降低对矿质元素的吸收。对蓝莓[17]、沙枣[18]和西伯利亚白刺[19]耐盐性的研究结果表明，盐胁迫不仅使大量元素的吸收减少，同时也削弱了对微量元素的吸收，导致植物体内营养元素缺乏和细胞内代谢紊乱。本试验结果表明，在同等盐浓度胁迫下，AMF 接种的Cu 和Zn 含量显著高于未接种，这与对刺槐[20]的研究结果一致，盐胁迫下接种AMF 后矿质元素含量升高主要是由于盐胁迫使生物量下降较多，其余元素含量在较少的生物量中积累升高所导致。盐胁迫下，植物通过调节有机物质如Pro、可溶性糖等的含量来提高其耐盐性[21]，这些物质的积累有利于植物在高盐胁迫下对水分的吸收，保证细胞的正常生理功能[22-23]；其中，Pro 能够降低细胞的水势，调节渗透平衡，AMF 可以通过增加Pro的积累来提高植物的耐盐性。本试验中，NaCl 浓度为100、200 和300 mmol·L-1时，AMF 接种比未接种的桢楠Pro 含量分别增加了28.34%、39.37%和57.82%，表明AMF 接种能够增加Pro 含量，但随着盐浓度增加，AMF 接种的桢楠Pro 含量呈先升后降的趋势，当盐浓度超出一定范围（在本试验中为200 mmol·L-1）时Pro 含量便下降。这与沙枣、小麦[24]、麻黄[25]等在盐胁迫下接种AMF 后Pro 含量的变化规律一致。

对盐胁迫下大麦和小麦[26]等叶片脂质过氧化的研究发现，盐分可以增加膜的透性，增强脂质过氧化作用。SOD、POD、CAT 及APX 是植物体内的抗氧化酶系统，通过相互协调来清除活性氧和丙二醛[27]。本研究中，AMF 接种比未接种的桢楠SOD、POD、CAT 和APX 活性均增加，表明AMF 能够提高桢楠的抗氧化酶活性；本试验中，NaCl 浓度为200 mmol·L-1时，SOD、POD、CAT和APX 活性均下降，这与张勇等[28]的研究结果一致，红芪在低盐胁迫下通过提高SOD、POD 活性来加强自身的耐盐性，但当盐浓度超出一定范围时，SOD、POD 活性便开始下降，这说明虽然植物在受到盐胁迫时能够通过提高自身酶活性来清除有害离子，但一旦超过一定浓度范围便会导致保护酶活性下降，其保护作用大大降低。