旺苍县茶树资源遗传多样性分析及分子身份证构建

2023-07-26石保旭郑梦霞向云攀王波石娇娇陈九江唐杰万华兰张品荔

中国茶叶 2023年7期

石保旭　郑梦霞　向云攀　王波　石娇娇　陈九江　唐杰　万华兰　张品荔

摘要：旺苍县茶树种质资源丰富，茶种业现代农业园区种质资源圃收集保存了大量本地和国内外代表性茶树资源。本研究利用SSR分子标记检测技术对旺苍县茶树资源圃保存的部分资源进行了遗传多样性分析，为检测资源建立了准确的分子身份证；对17份本地古茶树资源进行了理化成分的全面测定，筛选鉴定出1份低咖啡碱种质。研究结果对旺苍县茶树种质资源鉴定、遗传多样性分析和新品种选育具有重要意义。

关键词：茶树；SSR分子标记；遗传多样性；分子身份证

中图分类号：S571.1；S330 文献标识码：A 文章编号：1000－3150（2023）07-46-8

Genetic Diversity Analysis and Molecular ID

Construction of Tea Resources in Wangcang County

SHI Baoxu1， ZHENG Mengxia2， XIANG Yunpan1*， WANG Bo1*， SHI Jiaojiao2，

CHEN Jiujiang1， TANG Jie3， WAN Hualan1， ZHANG Pinli3

1. Sichuan Wangcang County Tea Industry Technology Research Institute， Wangcang 628200， China;

2. Tea Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Hangzhou 310008， China;

3. Agricultural and Rural Bureau of Wangcang County， Sichuan Province， Wangcang 628200， China

Abstract： Wangcang County is rich of tea germplasm resources. A large number of local and abroad representative tea germplasm resources had been collected and preserved in the tea germplasm resource nursery of modern agricultural park. In this study， SSR molecular marker detection technology was used to analyze the genetic diversity of some tea resources preserved in the resource nursery in Wangcang County， and an accurate molecular identity system was established for the detection of germplasm resources. The physical and chemical components of 17 local ancient tea resources were comprehensively determined， and one low caffeine germplasm was identified. The results are of great significance for the identification， genetic diversity analysis of tea germplasm resources and new cultivar breeding in Wangcang County.

Keywords： tea plant （Camellia sinensis）， SSR molecular marker， genetic diversity， molecular identity card

茶樹是世界上最重要的饮料经济作物之一，被广泛种植于全世界超过50个国家和地区。地处四川盆地北缘、米仓山南麓的旺苍县，属亚热带湿润季风气候，土壤富硒富锌，适宜茶树生长。旺苍县茶树种质资源丰富，大两镇等地古茶树分布较为集中且保存完善。2020年建设的茶种业园区，具有茶树种质资源保护、品种创新、种苗繁育等功能，在木门镇三合村建成的茶树资源圃收集保存本地和国内外代表性资源350份。种质资源是开展茶树种质创新和新品种开发的重要基础，因此，对旺苍县境内茶树种质资源的遗传多样性进行研究具有重要意义。

20世纪80年代以来，DNA分子标记技术早已成为研究植物遗传多样性和遗传演化的有效工具。其中，简单重复序列标记（Simple sequence repeat，SSR），具有重复性好、多态性丰富、通用性高、操作简便快速等优点，2005年起就被国际植物新品种保护联盟（UP-OV）推荐作为建库优选的标记。Yao等[1]利用96对EST-SSR分子标记研究了来自我国14个茶区的450份资源，发现来自广西、云南和贵州的茶树遗传多样性最高，距离这些茶树起源中心越远，遗传多样性逐渐降低。毛娟等[2]发现样本量在40个时，能够较好地反映云南白莺山茶树资源的遗传多样性。罗亦纾等[3]通过21对SSR引物对35份重庆大茶树种质资源进行研究，结果显示其中南川1号和南川2号的亲缘关系最近。刘冠群等[4]利用SSR分子标记为24份名山良种繁育场具有代表性的茶树品种构建二维码身份证。李长乐等[5]利用SSR分子标记对来自12个省份的地方群体品种进行研究，发现供试种质可划分为四大类型，具有明显的地域分布规律。

本研究利用15对SSR引物对旺苍县茶树资源圃保存的资源进行PCR扩增，采用荧光标记毛细管电泳检测扩增产物，建立起保存资源的分子身份证，以期从分子生物学角度对茶树资源快速准确区分。同时在种质资源丰富的大两镇选取了17份茶树种质资源，进行理化成分（5项常规和儿茶素组成）的测定分析，为利用旺苍本地资源进行本土化优质品种选育提供数据基础。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究共采集种植于旺苍县茶树种质资源圃内的160份茶树资源的叶片组织，样品采集后液氮迅速冷冻处理，保存在－80 ℃冰箱中备用。另在大两镇采集17份茶树新梢，制成晒青干茶用于内含物检测。

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

将各份材料分别磨样，使用艾德莱CTAB植物基因组DNA快速提取试剂盒（DN14）提取样品全基因组DNA，并用l%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，用超微量分光光度计检测其浓度，样品检测合格后－20 ℃保存备用。

1.2.2 PCR扩增及产物检测

15对SSR荧光引物的信息（表1）参考Ma等[6]、谭礼强[7]和徐礼羿等[8]的文献报道。PCR反应体系为KAPA 2G Robust Mix 7 μL，模板DNA 1 μL，Primer-F、Primer-R（10 mmol/L）各1 μL。PCR反应程序为94 ℃预变性5 min，然后94 ℃变性30 s，退火30 s（退火温度根据所用引物确定），72 ℃延伸1 min，共计30个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR产物使用3730 xl DNA分析仪进行毛细管凝胶电泳检测。

1.2.3 数据统计分析

运用PowerMarker和PopGene统计每对引物在160个茶树品种中扩增等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）、Shannon多样性指数（I）、Nei's基因多样性指数（H）、基因型数（Genetype）和多态性信息量（PIC）。运用PowerMarker计算各品种间的Nei's遗传距离，并基于Nei's遗传距离进行Neighbor-Joining聚类分析。

1.2.4 茶树SSR分子身份证构建

根据每对引物在不同品种上扩增的等位基因数进行赋值，赋值方法参考张小双[9]的方法：将每对引物在每个材料上扩增出的等位基因从小到大排列，并用阿拉伯数字1～9进行编码，当基因数大于9时，分别用a、b、c……进行编码，以此类推，即可得到由26位数字或字母组成的分子身份证。

1.2.5 理化成分测定

水浸出物含量按照《茶水浸出物测定》（GB/T 8305—2013）全量法测定；游离氨基酸含量按照《茶游离氨基酸总量的测定》（GB/T 8314—2013）茚三酮比色法测定；咖啡碱含量按照《茶咖啡碱的测定》（GB/T 8312—2013）紫外分光光度法测定；茶多酚和儿茶素类含量按照《茶葉中茶多酚和儿茶素类含量的检测方法》（GB/T 8313—2018）测定。

2 结果与分析

2.1 SSR引物的多态性

15对SSR引物对160份供试材料的遗传多样性分析结果如表2所示。15对SSR引物共扩增出144个等位基因（A），各引物扩增出的等位基因数为4～19个，平均9.6个；Ne为2.51～10.87个，平均5.31个；共检测到441个基因型，平均每对引物为29个。Ho最大值为0.956 3，最小值为0.562 5，平均值为0.733 8；He最大值为0.910 9，最小值为0.604 0，平均值为0.777 2，Ho小于He，表明在群体内存在非随机交配现象。I变化范围较大，为1.050 2～2.547 5，平均1.757 8。H为0.602 1～0.908 0，平均值为0.774 8。各引物扩增的PIC为0.520 3～0.900 8，平均为0.742 4，15对引物均为多态性高（PIC>0.50）的引物，尤其以CsFM1823引物的PIC最高，为0.900 8，扩增得到等位基因18个，基因型个数66个。

2.2 基于SSR标记的聚类分析

基于15对SSR引物等位基因出现的频率计算Nei′s遗传距离（D），并由此对160个供试材料进行Neighbor-Joining聚类分析。聚类结果如图1所示，160份材料可划分为3个大的类群，类群间资源数量相当，且类群内部聚类分支多样。已知龙井黄是龙井43芽变后代，二者聚于同一分支；白鸡冠后代、极白茶等来自白化茶树的资源均聚于同一分支。

2.3 分子身份证编码

根据前文提及的等位基因赋值标准，将15对SSR引物对每份茶树样品的扩增结果按照从小到大的顺序排列，将其转换为字符进行串联排列，并用阿拉伯数字和英文小写字母进行赋值。例如，引物CsFM1068对全部供试材料扩增共获得19个等位基因，最小为188 bp，最大为257 bp。将全部等位基因从小到大进行排列，即等位基因188 bp赋值为1，以此类推，等位基因257 bp赋值为j。根据以上方法，获得了每份材料的分子身份证（表3）。

2.4 旺苍县地方茶树种质资源主要理化成分分析

理化成分检测结果（表4）表明，旺苍县大两镇收集的种质资源样品水浸出物含量为46.6%～53.2%（平均49.5%）；茶多酚含量为16.4%～23.0%（平均18.9%）；游离氨基酸含量为1.8%～3.9%（平均2.7%）；酚氨比为5.1～12.3（平均7.2），其中6个样品（大两1、大两3、大两8、大两13、大两16和大两19）的酚氨比低于7，具有适制绿茶的物质基础；咖啡碱含量为0.7%～4.1%（平均2.6%），其中大两11的咖啡碱含量极低，仅为0.7%，具有选育低咖啡碱品种的潜力；表没食子儿茶素（EGC）为2.41%～5.67%、DL-儿茶素（DL-C）为0.18%～0.75%、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）为4.83%～10.41%、表儿茶素（EC）为0.68%～1.73%、表儿茶素没食子酸酯（ECG）为1.10%～2.63%，儿茶素品质指数为142.79～486.31（平均241.88），儿茶素品质指数愈大，则鲜叶嫩度和品质愈好。

3 小结与讨论

黄丹娟等[10]以13个湖北省优良茶树品种为供试材料，采用30对SSR荧光引物进行标记，结果显示平均等位基因数为4.83，平均PIC为0.58；刘冠群等[11]筛选出7个SSR标记对24份名山茶树进行扩增，发现平均等位基因数为4，平均PIC为0.56；毛娟等[12]利用30对茶树核心SSR引物在对3个代表性的野生和栽培大理茶居群中检测到的平均等位基因数为5.9，平均PIC为0.491。本研究所用的15对引物在160份材料中共扩增出144个位点，平均每对引物检测到9.6个位点，平均PIC为0.742 4，所有引物的PIC>0.5，说明本研究选用的15个SSR标记表现出很高的多态性和杂合性，保证了每份材料都具有独特的分子身份证。本研究分析获得的160份茶树资源基因多样性范围在0.602 1～0.908 0，平均值为0.774 8，说明资源圃收集保存的茶树具有较高的遗传多样性。将供试材料聚类分为3个类群，且与供试材料的原产地关系较小，下一步可以利用这些资源进行人工杂交等创制新种质和选育新品种。

分子身份证与指纹图谱的功能相同，但指纹图谱存在谱带较多、人工比对低效和繁琐等问题，限制了其在大规模品种鉴定中的使用。而分子身份证是将指纹图谱进行数字化得到字符串形式的结果，可以通过计算机自动比对，特别是条形码身份证可以被扫码器快速识别。目前，许多植物已利用SSR标记技术构建分子身份证。张枭等[13]将14对SSR引物获得的相应等位基因赋值编码，串联构建山楂资源的分子身份证；李慧峰等[14]利用SSR荧光标记绘制了41份山东省苹果资源的分子身份证；苑克俊等[15]构建了4个杏新品系的分子身份证，为利用分子鉴定进行品种权保护提供了依据；武志江等[16]从200对EST-SSR引物中筛选出20对核心引物，成功构建了145份火龙果种质资源的分子身份证。在构建分子身份证时，常采用的编码方法有3种，本研究选择将每对引物扩增的等位基因按从小到大排列、依次编码的方法，从而获得数字与字母结合的分子身份证，然后再转化为条形码，可以快速高效地对茶树资源进行鉴定。

研究表明，过量摄入咖啡碱会使人体产生焦躁不安、失眠、血压升高等不良反应。通常，茶叶中咖啡碱含量在3%～5%，若咖啡碱含量低于1%，则属于低咖啡碱茶树资源。目前，研究低咖啡碱茶已成为茶叶资源利用、茶叶精深加工及有机食品开发等领域的重要课题。唐一春等[17]从保存在勐海国家茶树种质分圃的100份茶树资源中筛选出2份咖啡碱含量分别为0.07%和0.06%的茶树种质。杨维时等[18]尝试用茶树与油茶嫁接选育低咖啡碱茶树品种。本研究对17份来自旺苍县大两镇的种质资源进行理化成分测定，发现1份样品的咖啡碱含量仅为0.7%，有望作为选育低咖啡碱茶树品种的材料。

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