水稻萌发耐淹性的遗传分析

李 姗

（湖北大学，湖北 武汉 430062）

水稻在国计民生和农业生产方面有着重要的影响，是最普遍的农业经济作物品种之一。水稻生长期间一旦发生水淹，会引起水稻缺氧，植株会通过厌氧呼吸来获取氧份（养份）维持其基本的生理活动，同时会产生乙醇。若水稻植株长时间处于缺氧状态，则会因产生过多的乙醇而中毒，造成稻秧植株组织溃败，导致植株萎缩或死株等。缺氧在很大程度上还会加重水稻稻瘟病、立枯病的发生，是制约水稻生产的重要因素。

2019 年孙凯等人利用200 份来源广泛的水稻种质为材料，在有氧环境下进行萌发试验，测量种子萌发率、萌发指数和活力指数；在低氧条件下测量芽鞘长和芽鞘直径；进行耐淹成苗试验，测定耐淹成苗率。发现种子活力、芽鞘长与耐淹成苗率密切相关，可作为筛选高耐淹成苗水稻材料的重要性状。进行了全基因组关联分析、转录组分析与基因表达模式比较的联合应用，可提高候选基因的筛选效率。分析了影响耐淹成苗率的关键表型性状，挖掘相关的遗传位点和候选基因[1]。2020 年王杰等人对水稻育种发展趋势进行了分析，综述了水稻耐淹水萌发表型的遗传研究、基因鉴定、连锁分子标记开发等工作，并指出了该领域应用研究的关键问题[2]。2021 年孙志广等人对来自不同年代和地区的191 份粳稻种质资源进行了萌发耐淹性鉴定，共获得12份萌发耐淹性强的种质资源，其中连粳15号表现出较强的低氧萌发能力。利用其与籼稻品种构建的分离群体，采用模拟大田的鉴定方法，在水稻1号、3号、9号、10号染色体上共检测到4个QTL[3]。

虽然已有较多的水稻低温萌发农艺性状的研究报道，但针对耐淹萌发的表现和遗传鉴定研究较少。本研究利用具有遗传多样性的种质资源构建自然群体，结合实验采集、分析水稻遗传数据，以期为选育耐淹品种、提高水稻产量提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验以200 份常规粳稻为试验材料，来自于东乡野生导入系自然群体。

1.2 试验试剂

本实验所用试剂包括次氯酸钠、无水乙醇、氢氧化钠、乙二胺四乙酸、琼脂糖、蛋白胨、酵母提取物、硼酸、氯化镁、曲拉通、肌醇、蔗糖、葡萄糖、硝酸钾、硫酸铵、硫酸镁、硫酸铜、硫酸亚铁、硫酸锌、磷酸二氢钾、钼酸钠、谷氨酰胺、脯氨酸、水解酪蛋白等。

实验所用灭菌水为超纯水，DNA 提取液采用EDTA 法配制。

1.3 试验设备

电热恒温水浴锅、电子天平、离心机、植物组织破碎仪、漩涡振荡器、磁力搅拌器、pH 计、移液枪、PCR 仪、微波炉、电泳仪、电泳槽、恒温摇床、光照培养箱、根系扫描仪。

1.4 试验方法

1.4.1 种子萌发试验

200份自然群体材料，每个材料设3 次生物学重复，每个重复内分2 次技术重复，每个技术重复取100粒种子，放置在铺好的两层中速定性滤纸的9 cm 直径培养皿上，加10 mL 超纯水，盖上培养皿盖子，放置在恒温光照培养箱中培养7 d，培养箱内温度设置为30℃，光照设置为光照8 h、无光照16 h。每隔24 h 测量记录萌发种子个数持续7 d，第7 d 记录未萌发种子数，测量萌发率、萌发势、萌发指数和活力指数。

式中：Gt——第t天新萌发的正常幼苗数；Dt——萌发的天数。

1.4.2 淹水低氧萌发试验

200份自然群体材料，每个材料设3 次生物学重复，每个重复内份4 次技术重复，每个技术重复取5 粒种子（筛选去除空粒、瘪粒的种子），放置在50 mL 透明塑料离心管中，加满超纯水并盖紧盖子造成淹水低氧环境，放置在恒温光照培养箱中培养6 d，培养箱内温度设置为30℃，光照设置为光照8 h、无光照16 h。6 d 后用根系扫描仪测量芽鞘长度及芽鞘直径。

1.4.3 遗传图谱构建/全基因组关联分析

采用琼脂糖凝胶电泳分析DNA 的纯度和完整性，Nanodrop 检测DNA纯度，Qubit 进行浓度分析定量。

采用GWAS 专业分析软件，采用混合线性模型，对群体结构和个体亲缘关系进行校准，同时减少计算时间。并利用已经公布的SNP 数据，对不同群体的相关性状进行关联分析，查找出潜在的候选的基因点位。

1.4.4 筛选候选基因/关联位点分析

如果某一个SNP 位点与表型性状呈显著关联，那么就认为这个SNP 与表型数据存在协同变异关系。根据和水稻基因组注释，查找与其相关的基因作为重要的候选基因。根据己发表的文章，查找己定位的QTL，查找在水稻中存在的同源基因。与GWAS 显著峰值位点进行比对，查找到候选基因。

2 试验结果与讨论

2.1 水稻种子正常萌发表现

对200 份自然群体材料在正常条件下的10 个表型进行调查。其中萌发指数标准误差最大，是0.681 5，正常苗干质量和正常根干质量标准误差最小，是0.000 1；说明萌发指数的离散程度最大，品种间的差异也越大。正常根干质量变异系数最大，是0.393 4，萌发率变异系数最小，是0.051 6。

2.2 水稻种子水淹低氧萌发表现

低氧条件处理200 份自然群体材料，对群体材料的芽鞘长、芽鞘直径、苗长、总根长、苗鲜质量、根鲜质量、苗干质量以及根干质量进行调查并进行统计分析。其中总根长标准误差最大，是0.106 7，苗干质量和低氧根干质量最小，接近零说明低氧总根长的离散程度最大，品种间的差异也越大。根干质量变异系数最大，是0.457 6，芽鞘直径变异系数最小，是0.073 2。

表1 正常萌发与水淹低氧萌发数据对比Tab.1 Comparison of normal germination and waterlogged hypoxic germination data

2.3 关联位点分析

使用Plink 软件，将等位基因频率MAF＞0.05 和缺失率＜0.1作为阈值，对所选择的200份自然群体材料的SNP数据进行筛选。群体分层分析主要分为群体进化树分析和主成分分析，两者的结果可以进行相互验证[4，5]。距离矩阵采用TreeBest 软件计算，采用邻接法构建系统进化树。引导值经过达1 000 次计算获得；此群体主要可分为两个亚群，第一个亚群共6个材料，另外一个亚群包括其他194材料。

利用200 份水稻自然群体品种进行简化基因组测序，基因组大小为374424240bp，群体样本平均比对率为96.17%，对基因组的平均测序深度为14.16X，平均覆盖度为11.24%，至少有4 四个碱基的覆盖度为5.99%。SAMTOOLS 软件检测共获 得 了652 457 个SNP 位 点，经 过 条 件 为dp2、Miss0.9、Maf0.01 的过滤后，最后共获得了161 657 个高质量的SNP 位点用于后续分析。对200份材料的耐淹苗干质量进行全基因组关联分析，共检测到了10 个与耐淹苗干质量相关的SNP位点，基于水稻基因组注释，依据LD 衰退水平，本研究在关联SNP 位点上下游区域，共检测到227 个基因，对其中9 个与本研究相关的基因进行注释。在关联位点Chr01_35309315 附近找到了一个与WRKY24 转录因子相关的基因；在Chr08_20219220 位点附近找到了3 个基因，分别为编码含CCHC 型结构域的锌指蛋白基因，编码含PHD 型结构域的锌指蛋白基因以及编码含CAH1 结构域碳酸酐酶基因；在Chr08_19427880 位点附近找到了4 个基因，分别是编码乙醇脱氢酶基因，编码亮氨酰-tRNA 合成酶基因和两个编码含PHD 型结构域的锌指蛋白基因；在Chr12_10787959 位点附近找到了一个编码热休克蛋白DnaJ 的基因。

3 结论

对200 份水稻品种的萌发耐淹性检测结果表明，水稻群体内耐淹萌发性状存在广泛的表型变异。主要成分分析说明水稻群体内部存在明显的群体结构，这种结构对于关联分析有着较强的影响。利用主要成分作为关联分析的协变量，可以提高关联分析的准确度。对200份材料的耐淹水稻干重进行全基因组关联分析，共检测到了10个与耐淹水稻干重相关的SNP 位点，基于水稻基因组注释，通过LD 衰减水平，在的关联SNP 位点上下游区域检测到227 个基因，对其中9 个为关联候选基因。在对更有代表性的核心种质进行评价时，发现粳稻萌发耐淹能力并不是单纯的较强，而是表现出较大的差异，这不同于侯名语（2004）等人的研究，他们提出了粳稻和粳稻萌发耐淹能力不同，粳稻的萌发耐淹能力也不同，而且可能表现出较强的缺氧萌发能力[6]。这很可能是因为所选择的实验材料的差异。本研究结果还发现胚芽鞘长为2.0～2.3 cm 的种质资源占比最多，达到48.2%，群体变异率为27.9%这说明粳稻品种的萌发耐淹性存在着广泛的遗传变异，这与王洋等（2009）研究结果相一致[7]。在该研究中，发现了一个QTL位点控制两个或多个性状的现象，曾长英（2006）指出QTL 的“多效性”是指同一QTL 位点同时作用于两个或多个数量性状，并对多个性状起调控作用[8]，而前期工作也证实了该现象。