菠菜中阿维菌素液相色谱法探讨

刘小丽

食品安全国家标准《水果和蔬菜中阿维菌素残留量的测定液相色谱法》（GB23200.19—2016）中介绍的检测方法，前处理复杂，分析时间长，且在实际检测过程中容易出现回收率低、检出限低、精密度差等问题。本文讨论了用液相色谱法检测菠菜中阿维菌素时的一些问题，这些问题对试验结果的回收率、稳定性、检出限、精密度会产生影响。针对上述问题展开方法优化与结果研讨，方法改进后，提高了检测方法的准确性和精密度。

一、材料与方法

（一）仪器

电子分析天平、振荡器、旋转蒸发仪、氮吹仪、涡旋混合器、固相萃取柱SPE C18、安捷伦1260高效液相色谱仪配紫外检测器。

（二）试剂

丙酮（色谱纯）、甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）、乙酸乙酯（色谱纯）。

（三）标准溶液

标准溶液由农业农村部环境保护科研监测所提供，质量浓度均为100 μg·mL-1。检测时，阿维菌素标准工作液用甲醇稀释至10.0 μg·mL-1。

（四）仪器工作条件

色谱柱为4.6 mm×125 mm安捷伦ODS-C18反相柱，流动相为甲醇：水=90：10，流速为1.0 mL·min-1；检测波长为245 nm，柱温为40℃，进样量为20 μL。

二、结果与分析

（一）前处理条件优化

试样称取20 g，用丙酮提取，浓缩后残渣太多；用布氏漏斗抽滤，每个样品需要清洗布氏漏斗，增加清洗工作量且易使样品交叉污染；蔬菜、水果含水量比较高，40 ℃温水旋转蒸发至2 mL，浓缩到最后基本都是水。

1.样品称取量及提取溶剂、提取方法的选择。试样称取20.0 g和10.0 g，分别选择了乙腈、乙酸乙酯和丙酮3种提取溶剂。回收率与称样量没有直接关系，三种提取溶剂回收率分别为 56.9%、89.2%、93.8%。选择称取试样量10.0 g，丙酮作为提取剂。

参考有关阿维菌素的提取方法相关文献报道，分别采用了离心、高速匀浆、超声三种提取方式。根据实验结果选择了超声提取 30 min后，于 4500 r·min-1条件下离心 5 min，待净化。

浓缩方法参考相关资料，分别比较了旋转蒸发和氮吹。根據实验结果，两种浓缩方法回收率分别为79.4%、95.7%，氮吹回收率相对较高。

2.样品净化过程中没有具体说明如何完全将浓缩提取液转入SPE C18柱。如果不润洗，回收率很低。本方法采用6 mL丙酮分3次润洗转入SPE C18柱，再用5 mL的水淋洗，去掉淋洗液。最后用5 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，用氮气吹至近干。

（二）样品制备和标样的添加

菠菜先切碎，再匀浆处理。在纯菠菜浆中添加阿维菌素标准溶液，分别添加质量浓度至 0.005 mg·kg-1、0.01 mg·kg-1、0.1 mg·kg-1，每个浓度重复 6 次，待其平衡1 h后进行样品提取。

（三）样品的提取、净化

菠菜样品称取 10.0 g，加入10 mL丙酮溶液超声提取 30 min，4500 r·min-1条件下离心5 min。取4 mL上清液于45℃条件下氮吹浓缩至2 mL，用6 mL丙酮分3次润洗转入SPE C18柱，再用5 mL的水淋洗，去掉淋洗液。最后用5 mL甲醇洗脱，收集洗脱液，用氮气吹至近干。准确加入1.0 mL甲醇溶解残渣，涡旋振荡1 min后静置30 min，吸取上清液过0.22μm滤膜过滤，于进样小瓶中保存，供液相色谱测定。

（四）标准曲线

校准曲线配制选择10.0μg·mL-1阿维菌素标准工作液，用甲醇做溶剂，配制5个浓度水平分别为0.005μg·mL-1、0.01μg·mL-1、0.05μg·mL-1、0.10μg·mL-1、0.20μg·mL-1 的标准工作溶液，配制完成后上机测定峰面积和保留时间。以峰面积为纵坐标，以进样浓度为横坐标，绘制标准曲线（见图1）。标准曲线的相关系数为0.999 5以上，符合《实验室质量控制规范  食品理化检测》（GB/T 27404—2008）标准要求。为加标色谱图农药残留量回收率判定提供了较好的依据。

（五）方法的准确性、精密度和检出限

根据试验检测结果表明，阿维菌素的保留时间为 32 min时峰形对称性良好。以外标法定量阿维菌素峰面积（y）与质量体积浓度（x）呈良好线性相关，线性回归方程为 y =5 7663x-14.334 ，相关系数（R2）为 0.999 5。

检出限指用某一方法可定性检测到样品中残留物的最小浓度，该水平信噪比一般为3 ，阿维菌素检出限为 0.002 ng·μL-1 时灵敏度高。

定量限指可以对基质中目标残留物进行准确定量测定的最低水平，在该水平下得到的回收率和精密度应满足分析的要求，添加标准溶液质量浓度得到的信噪比一般为10，本试验添加回收率条件下，显示阿维菌素峰形及重现性较好且无杂质干扰，阿维菌素在菠菜中的定量限为 0.005 mg·kg-1，低于阿维菌素在菠菜中的最大残留限量。

阿维菌素在菠菜中的平均回收率为 93.8%～97.2%，相对标准偏差为 5.5%～8.0%，添加浓度包含定量限，最大残留限量值，添加浓度能覆盖本残留试验中所有样品最高残留量，且不同添加浓度均符合回收率要求，用回收率试验的相对标准偏差衡量检测方法的精密度，不同添加浓度对相对标准偏差均符合要求（见表1）。

三、影响准确度与精密度的原因及解决方法

（一）色谱柱

当色谱柱污染后，峰面积会随着测定次数的增加而增加，影响测定结果的RSD值。实验过程中要确保色谱柱的干净程度，特别在进行比对时，要用干净的色谱柱。

（二）基质效应

同一种农药在不同蔬菜中有不同程度的基质效应，为了准确定量，理论上每种基质都需要制作对应的基质匹配标准曲线。为减少工作方法的工作量，在不影响结果准确性的前提下，选择一种有代表性的基质作为通用基质。

（三）注意事项

为保证数据准确，在操作过程中还要注意以下几方面。

1.清液移取4 mL前，用该液润洗3次移液管，保证吸取刻度准确。

2.氮吹时气流大了容易把液体吹出造成损失，气流太小氮吹时间延长，影响回收率。氮吹近干要求小烧杯内壁有潮潮的一层，吹干后回收率小。氮吹过程中要用干净滤纸擦去针头上的水珠，防止水珠落入瓶中氮吹不准确，影响结果。

3. SPE C18柱使用前用 5 mL 甲醇和 5 mL 水活化，净化时小柱不能干，当溶剂液面到达柱吸附层表面时，立即倒入净化溶液。小柱干了不容易洗脱，影响回收率。

四、结论

液相色谱法称取试样10 g，采用超声提取，净化浓缩处理后，采用高效液相色谱法测定阿维菌素的检出限为 0.002 ng·μL-1，定量限为 0.005 mg·kg-1。样品添加质量浓度分别为0.005 mg·kg-1、0.01 mg·kg-1、0.1 mg·kg-1，每个浓度重复 6 次，添加回收率为 92.5%～96.7%，相对标准偏差小于7.2%。此方法试验步骤操作简单，灵敏度高，经添加回收率试验表明得出的回收率、重复性均满足农药残留分析的要求，适用于水果、蔬菜中阿维菌素的批量检测。

（责任编辑   程丽红）