克氏原螯虾前列腺素E2受体EP4基因的序列特征及表达分析

江红霞,张 冉,李屹铮,刘雪巍,张帅帅,于 淼,王 磊,张 猛,乔志刚,李学军

( 河南师范大学 水产学院,水产动物疾病控制河南省工程实验室,河南省水产动物养殖工程技术研究中心,河南 新乡 453007 )

前列腺素(PG)广泛存在于动物体的各种组织和体液中,主要包括前列环素I2(PGI2)、前列腺素E2(PGE2)、前列腺素F2α(PGF2α)、前列腺素D2(PGD2)和血栓素A2(TxA2),由环氧合酶(COX)途径代谢产生[1],在炎症、免疫反应、心血管控制和大多数动物的繁殖中发挥着积极的作用[2]。而其中的PGE2则与许多雌性节肢动物的卵巢和卵母细胞的发育有关,如:PGE2量的增加可以促进日本囊对虾(Marsupenaeusjaponicus)处于卵黄发生阶段的卵巢的发育[3];给斑节对虾(Penaeusmonodon)饲喂含有PGE2的多毛类动物,卵母细胞发育速度和排卵效率有提高[4];给普通黄道蟹(Oziotelphusasenexsenex)施加PGE2,其性腺指数和卵母细胞直径以剂量依赖性方式不断增加[5]。

PGE2通过结合其特异性受体发挥功能。现已鉴定出4种不同的PGE2受体,分别为EP1、EP2、EP3和EP4。早期的研究指出,EP4分布十分广泛,其mRNA几乎在大鼠(Rattusnorvegicus)所有的组织中都能检测到[6]。虽然可以与EP4相结合的前列腺素类似物众多,但是其与PGE2的亲和力是最高的[7]。已有研究显示,EP4在动物体的卵巢发育、排卵和生殖调控方面也具有重要的作用,如Segi等[8]的研究表明,小鼠(Musmusculus)的卵巢在超排过程中表达大量的EP4 mRNA,且其原位杂交结果显示EP4 mRNA信号主要定位于腔前卵泡的卵母细胞,这些结果充分地证明EP4在排卵反应中起重要的调节作用。Bayne等[9]的研究也发现,在人的原始生殖细胞中发现有EP4的表达,且对一些重要的生殖调控基因的表达具有调节作用。

克氏原螯虾(Procambarusclarkii),属节肢动物门甲壳纲十足目螯虾科原螯虾属,俗名淡水小龙虾,是我国重要的淡水虾类养殖品种。克氏原螯虾营养丰富、肉质鲜美,深受人们的喜爱,近几年的价格也一路攀升,在我国具有非常重要的经济地位,据《2020中国渔业统计年鉴》[10]数据显示,2019年,全国克氏原螯虾养殖产量达到208.9604万t,在淡水甲壳动物养殖中位居第一位。随着克氏原螯虾在我国养殖规模的不断扩大,规模化养殖场需要在同一时期内提供规格整齐的苗种,因此,如何促进克氏原螯虾卵巢同步发育和排卵已成为克氏原螯虾规模化养殖产业中重要的研究课题。

笔者从克氏原螯虾卵巢转录组测序中得到EP4基因的包含有完整的开放阅读框的cDNA序列,命名为PcEP4基因,对该基因的cDNA序列进行生物信息学分析及表达模式的检测,并检测注射PGE2后雌虾卵巢中PcEP4基因的表达变化和虾的抱卵率变化,以期为克氏原螯虾卵巢同步发育和排卵的调控研究提供一定的基础资料。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用虾取自河南师范大学水产养殖基地,养殖水温20～25 ℃,每日早晚各投喂商品饲料1次,1周换水1次。采集卵巢发育处于成熟期(Ⅴ期)的雌性克氏原螯虾(25±5) g的不同器官、组织样品,包括卵巢、肝胰腺、心脏、胃、肠道、脑、眼柄、肌肉、鳃和腹神经索共10种;采集成年雌虾的Ⅰ～Ⅵ期的不同发育阶段的卵巢样品(Ⅰ期:卵原细胞增殖期;Ⅱ期:卵黄发生前期;Ⅲ期:初级卵黄发生期;Ⅳ期:次级卵黄发生期;Ⅴ期:成熟期;Ⅵ期:恢复期),卵巢分期参照李胜等[11]方法进行。每种试验样品采集6尾虾,样品获得后立即放入RNA保存液(天根,北京)中,并于冰箱-80 ℃保存,直到进行RNA的提取。

1.2 PcEP4基因cDNA序列的获得

利用RNA提取试剂盒(Omega公司)提取克氏原螯虾Ⅴ期卵巢组织的总RNA,提取步骤按试剂盒说明书进行。利用NanoDrop 2000分光光度计(Thermo,美国)和1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度、纯度和完整性,检测合格后,将卵巢RNA样品(20尾虾的混合样)送上海美吉生物医药有限公司进行转录组测序,建立克氏原螯虾卵巢cDNA文库,从文库中获得PcEP4基因的转录本序列,包含完整的开放阅读框。

1.3 PcEP4基因序列的生物信息学分析

使用在线软件对PcEP4基因进行序列分析,在线网址为: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ gorf/orfig.cgi(基因开放阅读框的预测)、http://web.expasy.org/compute_pi/(蛋白的理论相对分子质量以及理论等电点的预测)、http://www.dabi.temple.edu/disphos/(蛋白磷酸化位点预测)、http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/(蛋白糖基化位点预测)、http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/(蛋白的跨膜螺旋预测)和https://swissmodel.expasy.org/interactive(蛋白三维结构预测)等。通过Predict Protein软件对蛋白质进行亚细胞定位,应用ClustalX 2程序进行氨基酸多重序列比对,应用MEGA 5.0软件构建邻接系统进化树。

1.4 PcEP4基因在不同组织和不同发育阶段的卵巢中的表达分析

PcEP4基因在克氏原螯虾成虾的不同组织和不同发育阶段的卵巢中的表达模式利用实时荧光定量PCR法进行。首先利用RNA试剂盒(Omega公司)提取克氏原螯虾的不同样品的总RNA。利用NanoDrop 2000 分光光度计(Thermo,美国)和1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度、纯度和完整性。以RNA为模板,使用PrimeScript®RT reagent Kit with gDNA Eraser(TaKaRa)试剂盒合成用于qPCR反应的cDNA。依据PcEP4基因cDNA序列在其开放阅读框区设计荧光定量引物,上、下游引物分别为5′-GCTGGTGGAACCCTGTCATC-3′和5′-CCTCATA-CTCGTGGGCTCGT-3′,扩增片段大小为 158 bp;以18S rRNA作为内参基因,上、下游引物分别为 5′-TATACGCTAGTGGAGCTGGAA-3′和5′-GGGGAG-GTAGTGACGAAAAAT-3′。实时荧光定量PCR使用CFX96实时荧光PCR检测系统(Bio-Rad,USA)进行操作,反应体系按SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa,大连)试剂的说明书配制;反应条件为:95 ℃预变性30 s;95 ℃ 5 s,60 ℃ 30 s,共40个循环;72 ℃ 30 s。其中每个样品的目的基因和内参基因分别进行3次技术重复。采用2-ΔΔCt法[12]计算PcEP4基因在不同组织和不同发育阶段的卵巢中的相对表达量。利用SPSS 20.0软件对各数据进行单因素方差分析,并进行LSD多重比较和邓肯多重比较,当P<0.05时表明具有显著性差异。所有图片采用GraphPad Prism 5软件绘制,结果用平均值±标准误表示。

1.5 PGE2注射试验

PGE2粉剂(购自Sigma-Aldrich 公司,美国)溶于磷酸盐缓冲液,配制成2 mg/mL的PGE2母液。挑选卵巢发育处于Ⅴ期的克氏原螯虾分成2组,每组80尾虾,试验组用微量注射器在第2腹节处按照1.0 μg/g体质量的剂量[13]肌肉注射20 μL由母液稀释后的不同质量浓度的PGE2溶液,对照组注射同体积的磷酸盐缓冲液。在注射后的0、12、24、36、48、60、72 h,每个时间点每组各取6尾未抱卵虾,解剖取其卵巢,利用实时荧光定量PCR法检测PGE2注射对克氏原螯虾卵巢中PcEP4基因表达量的影响。实时荧光定量PCR方法同1.4部分。统计72 h后各组中所剩的抱卵虾占总虾数的百分比。在整个试验过程中有少量虾的死亡,对照组死亡率为15%,试验组死亡率为17.5%。总虾数为除去死亡和解剖后所剩的活虾。

2 结 果

2.1 PcEP4基因cDNA和氨基酸序列分析

PcEP4基因开放阅读框2505 bp,共编码835个氨基酸,推导的蛋白分子质量为93.246 ku,理论等电点为8.29,分子式为C4123H6363N1197O1216S34。在其氨基酸组成中,含量最高的是苏氨酸,占 9.7%,其次是丝氨酸和亮氨酸,各占9.0%和8.6%。另外,在该氨基酸序列上预测到35个磷酸化位点,包含14个丝氨酸、15个苏氨酸、6个酪氨酸,预测到2个糖基化位点,分别位于第49位和第173位氨基酸处。在该氨基酸序列上还预测到有7个跨膜α-螺旋结构域序列,分别位于第61～87、97～123、135～165、177～199、226～255、282～312和323～348位氨基酸处。跨膜α-螺旋序列及附近共有41个氨基酸残基构成配体结合口袋(图1)。

2.2 PcEP4氨基酸序列同源性比较及系统进化分析

利用美国国家生物技术信息中心BLASTP软件,将克氏原螯虾与其他已知动物的EP4氨基酸序列进行同源性比对,结果显示,克氏原螯虾的EP4氨基酸序列与其他已知动物的相似性为32%～50%,其中:与甲壳动物凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)的相似性最高,为49.1%;与鱼类中的斑马鱼(Daniorerio)和软体动物真蛸(Octopusvulgaris)的相似性次之,分别为32.2%和32.1%;与哺乳动物智人(Homosapiens)的相似性最低,为30.1%(表1)。

表1 克氏原螯虾与其他动物EP4氨基酸序列的同源性比对Tab.1 Comparative identity of amino acid sequence of EP4 between P. clarkii and other animals

利用Predict Protein软件对EP4进行了亚细胞定位,EP4定位于细胞膜部位(图2a)。利用Expasy在线软件预测了EP4的三维结构,发现该蛋白具有7个α-螺旋结构(图2b),结合TMHMM软件的跨膜螺旋预测,得知这是7个跨膜α-螺旋结构。使用Clustal X2将克氏原螯虾EP4氨基酸序列与其他动物的进行多重比对,发现他们均具有7个跨膜α-螺旋区,2个半胱氨酸残基形成的1个二硫键,3个配体结合残基和1个能与PGE2的羧基相结合的以精氨酸为中心的三联体,其氨基酸序列结构见图3。利用MEGA 5.0构建系统进化树,发现EP4进化树分为两大支,脊椎动物聚为一支,无脊椎动物聚为一支,克氏原螯虾EP4与其他无脊椎动物的聚为一支,并与其中的凡纳滨对虾的亲缘关系最近(图4)。

图2 预测的EP4的亚细胞定位(a)和三维结构(b)Fig.2 The predicted subcellular localization (a) and three-dimensional structure (b) of EP4图a中预测的EP4定位部分以绿色进行突出显示.The predicted positioning part of EP4 in figure (a) is highlighted in green.

图4 基于EP4氨基酸序列的邻接系统进化树Fig.4 Neighbor-joining phylogenetic tree based on amino acid sequences of EP4线的长度与遗传距离成正比,克氏原螯虾用“▲”表示.The length of the phylogenetic tree identified the genetic distance, and the EP4 of P. clarkii was marked by “▲”.

2.3 PcEP4基因的组织表达模式

PcEP4基因在成体克氏原螯虾不同组织中的表达模式见图5。由图5可见,PcEP4基因在所检测的10个组织中均有表达,但在成熟期卵巢中的相对表达量最高,其次是脑,在鳃中的表达量最低。PcEP4基因在成熟期卵巢中的表达量显著高于其他9种组织(P<0.05)。肠道、眼柄和鳃中的PcEP4基因的表达量无显著差异(P>0.05)。

图5 PcEP4基因在成年克氏原螯虾各组织中的表达模式Fig.5 Expression pattern of PcEP4 gene in different tissues of adult P. clarkii1.成熟期卵巢;2.肝胰腺;3.心脏;4.胃;5.肠道;6.脑;7.眼柄;8.肌肉;9.鳃;10.腹神经索;不同小写字母表示差异显著(P<0.05),下同.1.ovary; 2.hepatopancreas; 3.heart; 4.stomach; 5.intestines; 6.brain; 7.eyestalk; 8.muscle; 9.gill; 10.ventral nerve cord; means with different lowercase letters are significant differences (P<0.05), et sequentia.

2.4 PcEP4 基因在不同发育阶段的卵巢中的表达模式

PcEP4基因表达量随着克氏原螯虾卵巢的发育呈现出先升后降的趋势(图6)。 PcEP4基因的表达量在Ⅰ～Ⅴ期的卵巢中随着卵巢的发育逐渐升高,在Ⅴ期卵巢中达到最大值,然后在Ⅵ期卵巢中又下降。Ⅴ期卵巢中PcEP4基因的表达量显著高于其他5个时期的卵巢(P<0.05),Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅵ期卵巢中PcEP4基因的表达量无显著差异(P>0.05)。

图6 PcEP4基因在克氏原螯虾不同发育时期卵巢中的表达模式Fig.6 Expression pattern of PcEP4 gene in different ovarian stages of P. clarkii

2.5 PGE2注射对克氏原螯虾卵巢中PcEP4基因表达和抱卵率的影响

PGE2注射36 h后,卵巢中的PcEP4基因表达量与对照组相比极显著上升(P<0.01),注射48、60 h后,PcEP4基因表达量与对照组相比显著上升(P<0.05),而PGE2注射后0、12、24、72 h的PcEP4基因表达量与对照组均无显著差异(P>0.05)(图7a)。PGE2注射72 h后,对照组有11.7%的虾抱卵,而注射组有40.0%的虾抱卵,PGE2注射组虾的抱卵率高于对照组(图7b)。

图7 PGE2对克氏原螯虾卵巢中PcEP4基因表达(a)及抱卵率(b)的影响Fig.7 Effect of PGE2 on PcEP4 gene expression in ovary (a) and holding egg rate (b) of P. clarkii**表示与对照组相比差异极显著(P<0.01),*表示与对照组相比差异显著(P<0.05).** represent extremely significant difference at the level of P<0.01 from control, * represent significant difference at the level of P<0.05 from control.

3 讨 论

虾蟹类作为我国重要的水产养殖甲壳动物,其性腺发育的调控机制越来越受到人们的重视。目前,在水产甲壳动物的规模化繁育中,人工摘除眼柄的方法由于其有效性和方便性而广泛应用,以促进雌性虾蟹的卵巢的同步发育、快速成熟并提高其抱卵量[14-18]。但眼柄摘除会使亲虾亲蟹失去性腺抑制激素的调控,进而使后期卵巢发育成熟和排卵的速度过快,导致卵黄积累不足,卵子质量降低,生产的虾蟹苗容易死亡。同时眼柄摘除手术对亲虾亲蟹的损伤较大,死亡率也较高[19]。因此,从基因水平上来寻找新的人工调控水产甲壳动物卵巢发育的方法已成为研究的重点。目前,有关克氏原螯虾卵巢发育和产卵的调控基因的研究已有一些报道[20-22],但有关PGE2受体EP4基因在该虾卵巢发育和产卵过程中的调控作用的研究迄今尚未见报道。笔者从克氏原螯虾卵巢转录组测序文库中得到克氏原螯虾EP4(PcEP4)基因的cDNA序列,包含有2505 bp的完整的开放阅读框,编码835个氨基酸。截至目前,甲壳类EP4基因,仅凡纳滨对虾在美国国家生物技术信息中心数据库中登录有完整的编码序列,但尚无相关研究报道。

3.1 PcEP4基因序列特征

前列腺素受体是细胞表面七重跨膜受体的亚家族,是G蛋白偶联受体。G蛋白偶联受体是膜内在蛋白,受体内包含7个α-螺旋组成的跨膜结构域,这些结构域将受体分割为膜外N端、膜内C端、3个膜外环和3个膜内环。受体的膜外部分常带有糖基化修饰。膜外环上包含有2个高度保守的半胱氨酸残基,它们可以通过形成二硫键稳定受体的空间结构[23-24]。笔者将PcEP4基因所编码的EP4氨基酸序列与其他已知无脊椎动物的EP4氨基酸序列进行多重比对后发现,这些动物EP4的氨基酸序列均具有7个跨膜α-螺旋、2个半胱氨酸残基形成的二硫键,以及N端的糖基化位点。这些结构特点符合G蛋白偶联受体的特征,说明PGE2与受体EP4结合后激活G蛋白,从而启动不同的细胞内信号传导通路,引起生物体的各种生理反应。另外,在EP4的TM3中还有1个X-精氨酸-X的三联体。研究表明,在EP4细胞质末端与G蛋白的相互作用中,三联体是重要参与者,与信号转导有关[25]。

3.2 PcEP4基因组织表达和不同时期卵巢中的表达

PcEP4基因组织表达模式分析发现,在雌性克氏原螯虾成虾的各组织中,PcEP4基因在成熟期卵巢中的表达量显著高于其他9种组织,表明EP4受体在克氏原螯虾的卵巢中起着重要的作用。PcEP4基因在克氏原螯虾不同发育阶段的卵巢中的表达结果显示,该基因表达量在Ⅰ～Ⅴ期的卵巢中随着卵巢的发育逐渐升高,在Ⅴ期卵巢中达到最大值,然后在Ⅵ期卵巢中又下降,Ⅴ期卵巢中该基因的表达量显著高于其他时期的卵巢(P<0.05)。卵巢的整个发育周期中伴随着卵子的发生、发育、成熟和排出。在克氏原螯虾Ⅰ～Ⅳ期的卵巢发育中,其主要事件为卵原细胞分化为卵母细胞和卵母细胞的发育,在Ⅴ期卵巢中,卵母细胞已发育为成熟的卵子即将排出,而Ⅵ期则为卵子排空后的卵巢。据此推测EP4受体可能在克氏原螯虾卵巢中卵子的发育成熟和排卵中起重要的作用。在克氏原螯虾卵巢发育的卵黄发生期间,高效液相色谱法检测到其体内的PGE2持续增加[26];斑节对虾的卵巢和血淋巴中的PGE2的含量也随着卵巢的发育而不断增加[27]。这与本研究中PcEP4基因在克氏原螯虾Ⅰ～Ⅴ期的卵巢中表达量随卵巢的发育逐渐升高的规律一致。表明EP4作为PGE2的受体,其在克氏原螯虾卵巢内的多寡是受PGE2含量影响的,PGE2含量越高,卵巢中所需要的EP4受体也越多。

3.3 PGE2对卵巢中PcEP4基因表达和抱卵率的影响

为进一步确定PGE2与EP4之间的关系,笔者检测了PGE2注射后克氏原螯虾卵巢中PcEP4基因表达和虾的抱卵率的变化,结果发现,PGE2注射后48、60 h,PcEP4基因表达量与对照组相比显著上升(P<0.05),PGE2注射后72 h,注射组虾的抱卵率也高于对照组。此结果进一步验证了克氏原螯虾卵巢内EP4的多寡受PGE2含量的影响,PcEP4基因表达水平与PGE2含量一致。另外研究表明,PGE2具有促进动物排卵的作用[3,5],本试验中PGE2注射后72 h虾的抱卵率提高的研究结果也证实了这一点。以上研究结果均表明,EP4作为PGE2的受体,其在克氏原螯虾卵巢中含量和作用均与PGE2一致,且具有促进卵巢中卵子成熟和排卵的作用。

4 结 论

笔者通过转录组测序的方法从克氏原螯虾卵巢中得到了PcEP4基因cDNA序列,包含2505 bp的开放阅读框,编码835个氨基酸,其编码的蛋白是1个典型的具有7个跨膜α-螺旋结构的G蛋白偶联受体蛋白。在克氏原螯虾各组织中,卵巢中的PcEP4基因表达量最高,并在不同发育阶段的卵巢中,Ⅴ期卵巢中的表达量最高。PGE2注射会促进克氏原螯虾卵巢中PcEP4基因的表达和虾的排卵。EP4作为PGE2的受体在卵巢中与PGE2一起具有促进克氏原螯虾卵子的成熟和排卵的重要作用。本试验结果可为克氏原螯虾卵巢发育的分子调控机制的深入研究提供基础的分子生物学资料。