胃癌血清miR-375 和CHSY1 表达与幽门螺杆菌感染的相关性研究

蔡沾焕,陈 升,王艳良（儋州市人民医院/海南医学院附属儋州医院普通外科，海南 儋州 571700）

幽门螺杆菌（helicobacter pylori，Hp）可以触发胃部的体液和细胞免疫反应[1]。Hp感染与胃癌发病密切相关，因此寻找与Hp 感染相关的指标对指导胃癌的治疗具有重要意义。有研究证实，miRNA 表达水平的变化会引起胃癌发生，与胃黏膜细胞相比，胃癌细胞中miR-375 表达较低，且Hp 感染后miR-375 表达下调，表明miR-375 在Hp 感染胃癌中起重要作用[2-3]。研究表明，下调miR-375可促进胃癌细胞的增殖[4]。硫酸软骨素酶1（chondroitin sulfate synthase 1，CHSY1）参与胃癌的发生发展[5]。临床组织样本的免疫组化分析和公共数据库的数据挖掘显示，CHSY1 在胃癌中显著上调，且与肿瘤分期较晚、预后较差相关[6]。然而，目前对于胃癌患者miR-375 和CHSY1 表达与Hp 感染的关系还未完全阐明，本研究通过分析胃癌患者血清中miR-375和CHSY1的表达水平，探讨二者与Hp感染的相关性，以期为胃癌患者的早期诊断提供参考。

1 资料与方法

1.1 临床资料

选取2018 年6 月至2021 年6 月我院收治的胃癌患者96例设为胃癌组，另选取同期在我院就诊的慢性浅表性胃炎患者68例设为对照组。2组患者一般资料无显著差异（P＞0.05），具有可比性。胃癌患者纳入标准：①符合《胃癌:诊断和治疗方案的选择》[7]的标准；②首次确诊为胃癌。排除标准：①合并其他恶性肿瘤；②近3 个月有外科手术、放射治疗或内窥镜手术史；③具有炎症性疾病或免疫性疾病；④近6个月服用过抗生素或抗炎、胃黏膜保护类药物。本研究已经通过我院医学伦理委员会审核批准（18-00516），所有患者均签署知情同意书。

1.2 Hp感染检测

采用13C 呼气试验测定清晨空腹状态下所有患者Hp 感染情况。空腹服用13C 尿素胶囊30 min 后通过红外光谱仪进行呼气，呼出气体中13C原子峰大于基线5%时即为Hp阳性感染[8]。

Hp 感染密度检测[9]：在术中取适量胃癌患者距离幽门2 cm 的胃黏膜组织，光学显微镜下进行病理诊断，油镜下根据Hp 的感染密度将患者分为Hp 轻度组（轻度Hp感染，密度≤1/3）、Hp中度组（中度Hp感染，密度＞1/3～＜2/3）、Hp重度组（重度Hp感染，密度≥2/3）。

1.3 miR-375和CHSY1 mRNA表达水平检测

分别采集胃癌组患者入院后第2天清晨和对照组患者就诊当日清晨空腹静脉血3 mL，离心，分离上清，将血清储存于-80 ℃，避免反复冻融。利用TRIzol 试剂提取血清总RNA。利用PrimeScript RT 试剂盒合成cDNA。qRT-PCR 分析miR-375 和CHSY1 mRNA 的表达水平，采用2-△△Ct法进行分析。反应体系共12 μL：miScript SYBR®Green Mix 6 μL，cDNA 1 μL，上下引物各0.8 μL，ddH2O 3.4 μL。反应条件：95 ℃ 90 s，95 ℃30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 15 s，40 个循环。分别以U6、GAPDH 为内参。本研究引物由北京擎科生物公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列

1.4 统计学处理

采用SPSS 25.0 统计软件处理数据，计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用独立样本t检验，组内比较采用配对样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK-q检验。计数资料以率（%）表示，组间比较采用χ2检验。Spearman相关性分析血清中miR-375 和CHSY1 表达水平与胃癌患者Hp感染的相关性。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 Hp感染检测结果

胃癌组96 例患者中，Hp 阳性81 例（84.38%）；对照组68 例患者中，Hp 阳性30 例（44.12%）。胃癌组Hp感染阳性率显著高于对照组(χ2=29.493,P＜0.001)。

2.2 miR-375和CHSY1 mRNA表达水平比较

胃癌组Hp 阴性及Hp 阳性患者血清中miR-375 表达水平低于对照组（P＜0.05），CHSY1 mRNA 表达水平均高于对照组（P＜0.001）。胃癌组及对照组Hp 阳性患者血清中miR-375 表达水平低于Hp 阴性患者（P＜0.05），CHSY1 mRNA 表达水平高于Hp 阴性患者（P＜0.05），见表2。

表2 miR-375和CHSY1 mRNA表达水平比较（±s）

表2 miR-375和CHSY1 mRNA表达水平比较（±s）

*：与Hp阴性miR-375比较，P＜0.05；#：与Hp阴性CHSY1比较，P＜0.05

组别胃癌组对照组t P n 96 68 Hp阴性miR-375 0.88±0.12 0.95±0.08 2.476 0.017 CHSY1 1.25±0.13 1.12±0.06 5.007＜0.001 Hp阳性miR-375 0.76±0.08*0.85±0.15*4.074＜0.001 CHSY1 1.48±0.24#1.26±0.12#4.794＜0.001

2.3 不同Hp 感染患者血清中miR-375 和CHSY1 mRNA表达水平

油镜结果显示，8 例Hp 阳性感染胃癌患者Hp 轻度感染25 例，Hp 中度感染30 例，Hp 重度感染26 例。Hp阳性患者随着Hp的感染程度增加，miR-375的表达水平呈降低趋势（P＜0.05），CHSY1 mRNA 的表达水平呈升高趋势（P＜0.05），见表3。

表3 不同Hp 感染患者血清中miR-375 和CHSY1 mRNA 表达水平（±s）

表3 不同Hp 感染患者血清中miR-375 和CHSY1 mRNA 表达水平（±s）

*：与Hp轻度组比较，P＜0.05；#：与Hp中度组比较，P＜0.05

组别Hp轻度组Hp中度组Hp重度组F P n 25 30 26 miR-375 0.86±0.09 0.75±0.08*0.66±0.07*#39.662＜0.001 CHSY1 1.26±0.24 1.48±0.24*1.68±0.23*#20.046＜0.001

2.4 胃癌患者Hp 感染与血清miR-375 和CHSY1 表达水平的相关性分析

Spearman相关性分析结果显示，血清中miR-375表达水平与胃癌患者Hp 感染呈负相关（r=-0.648，P＜0.001），血清中CHSY1 表达水平与胃癌患者Hp 感染呈正相关（r=0.534，P＜0.001）。

3 讨论

胃癌是最常见的恶性肿瘤之一，进展快，预后差。全世界约有40 亿人感染Hp，其在复杂的胃环境中定居可破坏胃黏膜，导致宿主胃部炎症反应，引起消化性溃疡和慢性胃炎甚至是胃癌[10-11]。因此，寻找与胃癌患者Hp 感染有关的生物标志物，对于胃癌的早期临床治疗和预防具有重要的意义。

胃癌中miR-375 的表达较胃炎下调，且Hp 感染下的胃上皮细胞和胃癌细胞中miR-375 表达下调[4,12]。miR-375 已被证明可通过JAK2-STAT3 信号通路调控胃癌组织中PD-L1 的表达，从而调控癌症转移[13]。本研究结果显示，胃癌组Hp 阴性及Hp 阳性患者血清中miR-375 表达水平显著低于对照组，且胃癌组及对照组Hp 阳性患者血清中miR-375 表达水平低于Hp阴性患者，与以往研究结果一致[12]，提示miR-375 表达水平对Hp 感染胃癌患者的评估具有重要意义。同时，本研究Spearman相关性分析显示胃癌患者血清中miR-375 表达水平与Hp 感染呈负相关，提示miR-375水平与Hp 感染密切相关，检测miR-375表达水平有助于预测Hp 感染的发生，从而可对Hp 感染胃癌患者进行早期预防及治疗。

CHSY1 是一种介导硫酸软骨素聚合步骤的酶[14]。有研究表明，CHSY1 基因敲除可抑制结直肠癌细胞增殖、集落形成、迁移，并促进细胞凋亡[5]。CHSY1 基因敲除的胃癌细胞在体内的成瘤性降低，肿瘤生长减慢[15]。CHSY1 对于胃癌的发生具有促进作用，可作为判断患者预后的新指标，以及胃癌治疗的新靶点[7,16]。有研究发现，CHSY1 在肝细胞癌中频繁上调，可增强细胞生长、迁移、侵袭和上皮-间质转化[17]。本研究结果显示，胃癌组Hp 阴性及Hp 阳性患者血清CHSY1 表达水平均显著高于对照组，且胃癌组及对照组Hp 阳性患者血清中CHSY1 表达水平高于Hp 阴性患者，推测CHSY1 可能发生促癌作用，且其表达与胃癌患者Hp 感染有关。同时，本研究Spearman相关性分析显示血清中CHSY1表达水平与胃癌患者Hp 感染呈正相关，表明胃癌患者Hp感染与CHSY1表达水平有关，其有望成为胃癌患者Hp感染相关的生物学指标。

综上所述，在胃癌患者血清中miR-375 表达水平降低，CHSY1表达水平升高，miR-375表达与胃癌患者Hp 感染严重程度呈负相关，CHSY1 表达与Hp 感染严重程度呈正相关。但由于本研究样本量较少，研究结果有待更多研究来证实。