咪达唑仑抑制骨肉瘤细胞增殖、迁移并诱导其凋亡

季英龙,周全军,冀国力（潍坊市中医院麻醉二科，山东 潍坊 261041）

骨肉瘤是一种常见于儿童和青少年的骨恶性肿瘤，病死率和致残率高。尽管在接受手术和辅助化疗后，非转移性患者的5年生存率可达60%，但转移和复发患者长期生存率较低[1]。因此，有必要开发一种新药来改善不良的临床结局。近年来，麻醉药被报道可影响肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，参与癌症转移与复发，从而影响患者预后[2]。咪达唑仑作为术前用药，具有抗焦虑和镇静作用，有利于缓解患者术前焦虑[3-4]，可诱导肺癌和胃癌细胞凋亡，抑制细胞增殖，并抑制肺癌裸鼠移植瘤形成[5-6]。此外，咪达唑仑还可通过ERK 通路影响肝癌细胞周期和增殖[7]。然而，咪达唑仑对骨肉瘤细胞恶性潜能的影响尚未见报道。环状RNA（circRNA）是具有闭环结构的非编码RNA，其在骨肉瘤进展中具有重要作用[8]。以往研究表明，circ-NOL10 在肺癌和结直肠癌中低表达，上调circNOL10表达可促进肿瘤细胞恶性潜能[9-10]。然而，circNOL10在骨肉瘤进展中的作用尚不清楚。因此，本研究探讨咪达唑仑和circNOL10 在骨肉瘤细胞增殖、凋亡和迁移中的作用，并探讨咪达唑仑是否可通过调控circ-NOL10发挥抗肿瘤活性，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 组织样本与细胞

收集2020年1月至2021年12月于潍坊市中医院接受完全切除的38例骨肉瘤患者的骨肉瘤组织和邻近的非肿瘤骨组织（距匹配的骨肉瘤标本超过3 cm）。组织立即储存在-80 ℃冰箱中。患者术前均未进行抗癌治疗。本研究经潍坊市中医院伦理委员会批准（20190607024），所有患者均签署对本研究的知情同意书。人骨肉瘤细胞系MG63、U2OS、SAOS2、HOS、143B和正常成骨细胞系hFOB1.19购自美国典型培养物保藏中心。所有细胞系均培养于37 ℃、5% CO2及含10%胎牛血清的DMEM培养基中。

1.2 主要试剂

咪达唑仑（批号：210913）购自江苏恩华药业公司；si-NC、si-circNOL10、pcDNA、pcDNA-circNOL10 购自南京金斯瑞生物公司；兔源E钙黏蛋白（E-cadherin）多克隆抗体（AF0131）、兔源N-cadherin 多克隆抗体（DF3530）购自美国Affinity公司；羊抗兔IgG（ab205718）、CCK-8试剂盒、兔源GAPDH 多克隆抗体（ab245357）购自美国Abcam 公司；反转录试剂盒、SYBR Green qPCR master mix购自北京Takara公司；Annexin V-FITC/PI凋亡双染检测试剂盒购自上海锐赛生物公司；Transwell室购自美国BD公司。

1.3 细胞培养、转染及分组

U2OS细胞置于含10%胎牛血清、1%青-链霉素的DMEM培养基，在37 ℃、含5% CO2的培养箱中孵育。在24 孔板中接种对数期U2OS 细胞，当细胞汇合达60%时，用脂质体2000 将30 nmol/L 寡核苷酸（si-NC、si-circNOL10）或2 μg载体（pcDNA、pcDNA-circNOL10）转染U2OS 细胞，分别记为si-NC 组、si-circNOL10 组、pcDNA组和pcDNA-circNOL10组。转染48 h后，qRT-PCR检测细胞中circNOL10的表达情况以验证转染效果，然后进行后续实验。

用含0 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L咪达唑仑[7]的培养液孵育U2OS细胞，分别记为对照组、低咪达唑仑组、中咪达唑仑组、高咪达唑仑组；转染pcDNA-circNOL10、pcDNA 的U2OS 细胞分别记为pcDNA-circNOL10 组、pcDNA 组；用含100 μmol/L 咪达唑仑的培养液孵育转染si-NC、si-circNOL10 的U2OS细胞，分别记为咪达唑仑+si-NC 组、咪达唑仑+si-circNOL10组。

1.4 流式细胞术检测U2OS细胞凋亡率

用500 μL 结合缓冲液重悬1×106个U2OS细胞，加入10 μL Annexin-V FITC 溶液，室温孵育30 min，再将5 μL PI 溶液加入到U2OS 细胞中混匀，采用流式细胞术评估细胞凋亡率。

1.5 CCK-8法检测U2OS细胞增殖活性

将未经转染（对照组）或经转染的U2OS 细胞接种于96 孔板，贴壁后用含0 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L 咪达唑仑的培养液孵育48 h，然后用CCK-8检测细胞在450 nm处的吸光度（absorbance,A）。抑制率（%）=（A对照细胞-A处理细胞）/A对照细胞×100%。

1.6 Transwell实验检测U2OS细胞迁移能力

RIPA 法提取蛋白后，通过SDS-PAGE 分离等量蛋白，然后湿转到PVDF膜上。5%脱脂奶粉阻断膜后，分别加入一抗E-cadherin（1:1 000）、N-cadherin（1∶1 000）和GAPDH（1∶2 000），于4 ℃孵育过夜，再与二抗（1∶1 000）室温孵育膜2 h。化学发光法检测蛋白条带，用Image J软件分析免疫反应条带的相对密度以表示蛋白水平。

1.7 qRT-PCR检测circNOL10表达

与对照组比较，低咪达唑仑组、中咪达唑仑组、高咪达唑仑组U2OS 细胞E-cadherin 蛋白水平显著升高（P＜0.05），迁移细胞数、N-cadherin 蛋白水平显著减少/降低（P＜0.05），见图3、4。

1.8 Western blot 检测E-cadherin 和N-cadherin 蛋白表达

用无血清培养液重悬各组U2OS 细胞，并接种200 μL 细胞悬液于Transwell 上室，下室加入完全培养液。孵育24 h后，用棉签去除聚碳酸酯膜顶部的非迁移细胞，用1%多聚甲醛固定膜底部迁移30 min，用1%结晶紫染色。用倒置显微镜采集迁移图像，以5个随机视野细胞数均值表示迁移数量。

1.9 统计学方法

骨肉瘤是常见的骨恶性肿瘤，患者病死率高，预后差。近年来研究发现，静脉麻醉药物对肿瘤细胞（包括骨肉瘤）的增殖、凋亡与转移有直接作用；如丙泊酚可有效抑制骨肉瘤细胞的增殖和侵袭，诱导其凋亡[11]。咪达唑仑作为常用的静脉麻醉药物，已被用于肿瘤患者术前麻醉诱导和围术期镇静，且研究证实其在多种癌症中具有抗癌作用[5-7]。Shen 等[12]研究发现，咪达唑仑可抑制肝癌细胞转移并促进细胞凋亡。本研究结果显示，低、中、高剂量的咪达唑仑处理U2OS细胞后，其凋亡率和增殖抑制率升高，且随着剂量增加，咪达唑仑的效果逐渐增强，表明咪达唑仑可通过抑制U2OS 细胞增殖和诱导凋亡而发挥抗骨肉瘤作用。

首先，要在危险品道路运输中引入卫星定位系统、无线射频技术以及地理信息系统等现代化的技术，实现对危险品道路运输的过程监督，并在发生事故时向有关部门提供应急救援的基础支持。但是，当前这些现代化信息技术网络都是单独运行的，只可以在企业内部进行的危险品装载车辆信息进行监管。因此,必须采用信息化的技术手段，在长江三角洲内部建立危险货物运输管理信息系统并与各地区实现互通，来实现实时化、动态化、全过程的管理。

2 结果

2.1 circNOL10在骨肉瘤组织和细胞的表达情况

与正常组织比较，circNOL10 在骨肉瘤组织中的表达显著降低（P＜0.05），见图1a。此外，与正常成骨细胞系hFOB1.19 比较，骨肉瘤细胞系U2OS、MG63、SAOS2、HOS、143B 中circNOL10 的表达显著降低（P＜0.05），其中U2OS细胞中circNOL10的表达水平最低，见图1b。因此，选择U2OS细胞进行后续实验。

图1 circNOL10在骨肉瘤组织和细胞中的表达

2.2 咪达唑仑对骨肉瘤U2OS细胞增殖、凋亡的影响

与对照组比较，低咪达唑仑组、中咪达唑仑组、高咪达唑仑组U2OS 细胞circNOL10 表达水平显著升高（P＜0.05），见图5。

自动化的电网调度系统已经建立，但是与此相适应的认识上的发展和技术上的进步却没有得到同步发展，电网调度员的自身素质直接影响了电网的安全运行。例如，电网调度系统已经自动化了，但是许多调度员由于认识的不到位和业务素质的欠缺，仍然使用的是以前的手工操作的方法。现实中经常会出现几张申请票对应一张操作票的现象，靠手工作业的方法有时候难免会有遗漏，申请票一旦遗漏将会出现申请票还在执行中就给电的现象，结果将是造成恶性事故的发生，2004年华东网发生的恶性误操作事故就是由于此原因。

图2 咪达唑仑对骨肉瘤U2OS细胞增殖抑制率、凋亡率的影响

2.3 咪达唑仑对骨肉瘤U2OS细胞迁移的影响

用TRIzol 试剂从骨肉瘤组织和细胞以及各组U2OS 细胞中分离总RNA，使用反转录试剂盒合成互补DNA，以互补DNA 为模板进行qRT-PCR 扩增，检测circNOL10 表达。以GAPDH 为内参，用2-ΔΔCt方法评估circNOL10 表达水平。 circNOL10 上游引物为5'-CCCAACTCAGGCATGCTTCT-3'，下游引物为5'-CCCTCTATGGTTCCTGTGGC-3'；GAPDH 上游引物为5'-TCCCATCACCATCTTCCAGG-3'，下游引物为5'-GATGACCCTTTTGGCTCCC-3'。

图3 咪达唑仑对骨肉瘤U2OS细胞迁移的影响

图4 咪达唑仑对骨肉瘤U2OS细胞迁移的影响

2.4 咪达唑仑对骨肉瘤U2OS 细胞中circNOL10 表达的影响

与对照组比较，低咪达唑仑组、中咪达唑仑组、高咪达唑仑组U2OS 细胞抑制率、凋亡率显著升高（P＜0.05），见图2。

图5 咪达唑仑对骨肉瘤U2OS细胞中circNOL10表达的影响

2.5 circNOL10转染效率检测

pcDNA-circNOL10 组U2OS 细胞中circNOL10 表达水平较pcDNA 组显著升高（P＜0.05），提示pcDNA-circNOL10 转染成功。si-circNOL10 组U2OS细胞中circNOL10 表达水平较si-NC 组显著降低（P＜0.05），提示成功沉默circNOL10 可抑制circ-NOL10 表达，见图6。

图6 circNOL10转染效率

2.6 circNOL10 对骨肉瘤U2OS 细胞增殖、凋亡、迁移的影响

与pcDNA 组比较，pcDNA-circNOL10 组U2OS 细胞抑制率、凋亡率、E-cadherin 蛋白水平显著升高（P＜0.05），迁移细胞数、N-cadherin 蛋白水平显著减少/降低（P＜0.05），见表1。

表1 circNOL10对骨肉瘤U2OS细胞增殖、凋亡、迁移的影响（±s，n=9）

表1 circNOL10对骨肉瘤U2OS细胞增殖、凋亡、迁移的影响（±s，n=9）

*：与pcDNA组比较，P＜0.05

组别pcDNA组pcDNA-circNOL10组t P抑制率（%）0.00±0.00 25.28±3.14*24.153＜0.001凋亡率（%）6.50±0.48 19.82±0.84*41.304＜0.001迁移细胞数（个）169.78±7.49 84.22±3.71*30.709＜0.001 E-cadherin 0.21±0.03 0.55±0.04*20.400＜0.001 N-cadherin 0.66±0.06 0.25±0.02*19.448＜0.001

2.7 抑制circNOL10 表达逆转咪达唑仑对骨肉瘤U2OS细胞增殖、凋亡、迁移的影响

展开部长达120个小节（第95至214小节），在g小调上开始，使用了主部的主题材料。经过一系列的离调（a小调、d小调、c小调、降b小调）之后，在第150小节上，以降b小调出现了“假再现部”。然后在第161小节持续强调低音的降B音，右手则以半音上升，达到升G音，形成增六和弦，以不断增强的力度，强力返回到d小调的属和弦，为再现部的出现作准备。尾声之前再次出现类似手法，第323小节起，贝多芬不断地重复一个短小的音型，先是g小调，然后a小调，在第335小节，低音A持续了整整十六个小节，渐弱至pp，突然以ff返回主题，进入尾声，其效果极其富有戏剧性。

表2 抑制circNOL10对咪达唑仑处理的骨肉瘤U2OS细胞增殖、凋亡、迁移的影响（±s，n=9）

表2 抑制circNOL10对咪达唑仑处理的骨肉瘤U2OS细胞增殖、凋亡、迁移的影响（±s，n=9）

*：与咪达唑仑+si-NC组比较，P＜0.05

组别咪达唑仑+si-NC组咪达唑仑+si-circNOL10组t P抑制率（%）35.34±2.72 13.50±1.39*21.450 0.000凋亡率（%）22.22±1.21 12.12±0.60*22.435 0.000迁移细胞数（个）65.67±2.40 131.56±5.06*35.296 0.000 E-cadherin 0.74±0.05 0.40±0.05*14.425 0.000 N-cadherin 0.14±0.02 0.41±0.05*15.041 0.000

3 讨论

采用SPSS 20.0 统计学软件分析数据，数据以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，2 组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

首先，旅游危机事件当事人和利益攸关方是网络舆情的主要发布者和传播者。该主体发布的信息从根源上决定了旅游危机事件网络舆情的传播内容和信息，其发布的关于旅游危机事件的网络舆情信息比其他任何传播主体发布的信息都更有说服力和煽动性，因而更能决定网络舆情传播的走向。相关管理部门要迅速、合理地解决旅游危机事件，尽量减小对旅游危机事件当事人和利益攸关方带来的负面影响，从而达到控制舆情扩散的目的。

与咪达唑仑+si-NC 组比较，咪达唑仑+sicircNOL10 组U2OS 细胞抑制率、凋亡率、E-cadherin 蛋白水平显著降低（P＜0.05），迁移细胞数、N-cadherin 蛋白水平显著增加/升高（P＜0.05），见表2。

上皮间质转化（epithelial-mesenchymal transition,EMT）是上皮细胞失去细胞间黏附并获得迁移和侵袭能力的转化，EMT 可促使癌细胞转移和侵袭，是癌症进展和转移的必要条件[13]。E-cadherin是上皮标志物，N-cadherin 是间质标记物，下调E-cadherin 和上调N-cadherin 可增强细胞的运动能力，诱导上皮细胞向间质状态过度，促使骨肉瘤进展和转移[14]。本研究显示，咪达唑仑可减少U2OS 细胞迁移数量，同时降低U2OS 细胞N-cadherin 蛋白的表达，促进E-cadherin 蛋白的表达，这与迁移检测结果吻合，表明咪达唑仑通过逆转EMT 来抑制U2OS 细胞迁移，提示咪达唑仑可能通过抑制癌细胞EMT、迁移、增殖和促进细胞凋亡在骨肉瘤中发挥抑制作用。

有研究报道，circRNA 在骨肉瘤中表达异常，并参与骨肉瘤恶性进展[15-16]。circNOL10 在肺癌中表达下调，通过促进sclm1 介导的人素多肽家族的转录而抑制肺癌细胞增殖和阻滞细胞周期[17]。circNOL10 低表达与乳腺癌淋巴结转移及预后不良相关，过表达circ-NOL10 可抑制乳腺癌细胞增殖、EMT 和迁移[18]。为了研究circNOL10 在骨肉瘤中的作用，本研究检测了circNOL10 在正常组织、细胞与骨肉瘤组织、细胞中的表达，结果显示，circNOL10 在骨肉瘤组织和细胞中的水平降低；功能实验表明，过表达circNOL10 抑制了骨肉瘤细胞的增殖活力和迁移，加速了细胞凋亡，且上调了E-cadherin 蛋白表达，下调了N-cadherin 蛋白表达，与Wang 等[18]报道的circNOL10 在乳腺癌中的抑制作用吻合。本研究首次揭示了circNOL10 在骨肉瘤细胞恶性进展中的作用。

5.3 检查调整。对整机上各紧固螺丝、螺帽进行检查，发现松动要及时紧固;对主离合器、插秧离合器、秧针与导轨的间隙、秧针与苗箱的间隙等进行检查调整。

麻醉药可通过调控circRNA 水平影响肿瘤进展[19-20]。据报道，丙泊酚可通过调节肺癌中的circTADA2A/miR-455-3p 轴来抑制细胞癌变[21]；circ-HMGCS1低表达介导七氟醚抑制结肠癌细胞活力和侵袭，并促进细胞凋亡[22]。此外，有研究显示咪达唑仑可通过下调circASXL1 抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭[23]；表明咪达唑仑的抗癌作用可能与其调控circRNA 表达有关。本研究中，达唑仑处理后U2OS 细胞中circNOL10表达增加，过表达circNOL10和咪达唑仑对U2OS 细胞恶性潜能的抑制效应一致，推测circ-NOL10 可能介导咪达唑仑的抗骨肉瘤作用。为了验证此推测，本研究在咪达唑仑处理的基础上采用小分子干扰技术敲低circNOL10 表达，结果显示，抑制circ-NOL10 表达明显减弱了咪达唑仑对U2OS 细胞恶性行为的抑制作用，提示咪达唑仑可能通过上调circ-NOL10表达来抑制骨肉瘤细胞恶性行为。

By combining Eqs.(2)and(17),we can establish the following Hadamard shift invariance relationships between the GAMs of sub-arrays Xa1,Xa2and sub-arrays Ya1,Ya2,respectively,

综上所述，咪达唑仑可通过上调circNOL10 表达来诱导骨肉瘤细胞凋亡，并抑制其增殖和迁移，这为咪达唑仑在骨肉瘤进展中的作用提供了新的见解，并可能为患者选择更合理的麻醉药物提供实验依据。