REG3A 与PI3K/AKT 信号通路在卵巢癌组织中的表达及临床价值研究

蒋玲玲 刘颖蕾 刘曼华 郑艳莉 乔海风 陈丽平

我国是卵巢癌的高发国家,卵巢癌已成为威胁女性生命健康的常见恶性肿瘤之一。卵巢癌早期无典型症状,以致于很大部分患者一经确诊,已发展至中晚期,错失最佳的治疗时机［1］。研究报道指出［2］,卵巢癌的整体生存率在47%左右,但对于晚期卵巢癌患者,生存率明显下降,5 年生存率仅有29%左右。因此,如何实现早期科学准确地预警判断,对于卵巢癌早期科学防治具有重要意义。现有研究显示,卵巢癌的发生与相关信号途径激活有关,特别是与PI3K/AKT 信号途径密切关联。也就是说,通过对信号途径研究,对卵巢癌早期诱发因素的检测分析,可以实现早期科学预警,对卵巢癌临床诊治提供了重要保障。磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylin-ositol-3-kinase,PI3K)/AKT/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)信号通路是调节细胞周期、静止和增殖的重要细胞内途径,即PI3K/AKT/mTOR 信号通路激活能够促进上皮性卵巢癌(EOC)细胞的增殖、侵袭、迁移［3］。因此,对卵巢癌细胞REG3A 与PI3K/AKT 通路的表达研究,对于了解癌症分期进展及相关预后,具有十分重要的意义。本文选择本院2019 年1 月～2021 年12 月收治的60 例卵巢癌患者的卵巢癌组织及癌旁组织作为研究材料,就卵巢癌细胞REG3A 与PI3K/AKT 通路的表达情况进行如下阐述。

1 资料与方法

1.1 一般资料 本次研究选择本院2019 年1 月～2021 年12 月收治的60 例卵巢癌患者作为研究对象。纳入标准：①确诊为卵巢癌患者；②预期生存时间>6 个月患者；③无严重精神障碍患者；④按照规定完成组织留样患者。排除标准：①合并有其他恶性肿瘤患者；②合并有严重精神障碍患者；③不愿参与本次研究患者。所有患者年龄41～76 岁,平均年龄(52.67±7.88)岁。经癌症分期评价(tumor node metastasis classification,TNM)：Ⅰ期15 例,Ⅱ期20 例,Ⅲ期18 例,Ⅳ期7 例。本次研究经患者及其家属同意,并签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器 ①上海信帆生物科技有限公司提供的链霉亲和素-生物素复合物法免疫组织化学试剂盒；②美国Abcam 公司提供的REG3A 特异性-抗试剂盒及总RNA 提取试剂盒等；③上海信帆生物科技有限公司提供荧光定量聚合酶链式反应(PCR)试剂盒。

1.3 方法

1.3.1 样本组织中REG3A 表达的免疫组织化学检测 将卵巢癌及其癌旁组织制作成病理切片,经链霉亲和素-生物素复合物法免疫组织化学检测REG3A 的表达水平。经REG3A 特异性-抗染色之后,于高倍镜下进行相关结果的判读。本次研究中,染色强度的积分标准为0、1、2、3 分,并分别代表无染色、淡黄色、棕黄色、棕褐色。阳性染色细胞比率积分标准为0、1、2、3、4 分,并分别代表<10%、10%～25%、26%～50%、51%～75%、76%～100%。在阳性判断中,上述两项积分的乘积≥4 分,则为阳性,反之则为阴性。

1.3.2 样本组织中REG3A 表达的荧光定量PCR检测 采用总RNA 提取试剂对卵巢癌及其癌旁组织提取总RNA,并经荧光定量PCR 检测REG3A 的mRNA 表达水平。

1.3.3 样本组织中p-PI3K、p-AKT 的表达检测 将裂解液加入到卵巢癌及其癌旁组织中裂解,并提取相关蛋白。在经电泳分离之后,实现对不同分子量蛋白的分离,以及电转移至硝酸纤维素膜,之后放入5%脱脂牛奶中,温室孵育1 h,并在洗膜之后,放入1∶1000稀释的p-PI3K、p-AKT 一抗中4℃孵育过夜。在第2 天,经洗膜3 次之后,将硝酸纤维素膜放入1∶2000稀释的二抗中室温孵育,孵育也控制在1 h,最终在凝胶成像仪中显影得到 p-PI3K、p-AKT 的蛋白条带。

1.3.4 Real-time PCR 检测 REG3A 检测在4 株人卵巢癌细胞A2780、HEY、SKOV3、ES2 和1 株人正常卵巢上皮组织细胞中的表达。高表达REG3A 的细胞株：SKOV3、ES2 细胞；低表达REG3A 的细胞株：A2780、HEY 细胞。

1.4 观察指标 ①比较卵巢癌及其癌旁组织中REG3A 的表达情况；②比较卵巢癌及其癌旁组织中p-PI3K、p-AKT 的表达情况；③分析卵巢癌组织中REG3A 与p-PI3K、p-AKT 的相关性；④通过western blot 检测PI3K/AKT 通路中关键蛋白分子磷酸化情况。通过基因转染,构建REG3A 过表组卵巢癌细胞,继而阻断PI3K/AKT 通路,检测卵巢癌细胞增殖、细胞周期、细胞凋亡、细胞侵袭、细胞迁移和药物敏感性。

1.5 统计学方法 采用SPSS22.0 统计学软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差()表示,采用t检验；计数资料以率(%)表示,采用χ2检验；相关性检验采用Pearson 相关分析。P<0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 卵巢癌及其癌旁组织中REG3A 的表达情况比较 卵巢癌组织中REG3A 阳性率、REG3AmRNA 表达水平分别为65.00%、(1.02±0.19),均明显高于癌旁组织的31.67%、(0.71±0.14),差异具有统计学意义(P<0.05)。见表1。免疫组化检测卵巢癌组织和癌旁组织REG3A 的表达情况见图1。

图1 免疫组化检测卵巢癌组织和癌旁组织REG3A 的表达

表1 卵巢癌及其癌旁组织中REG3A 的表达情况比较［n(%),］

表1 卵巢癌及其癌旁组织中REG3A 的表达情况比较［n(%),］

注：与癌旁组织比较,aP<0.05

2.2 卵巢癌及其癌旁组织中p-PI3K、p-AKT 的表达情况比较 卵巢癌组织中p-PI3K、p-AKT 表达水平分别为(1.04±0.18)、(1.08±0.19),均明显高于癌旁组织的(0.72±0.17)、(0.53±0.09),差异具有统计学意义(P<0.05)。见表2。p-PI3K、p-AKT 的蛋白电泳图见图2。

图2 p-PI3K、p-AKT 的蛋白电泳图

表2 卵巢癌及其癌旁组织中p-PI3K、p-AKT 的表达情况比较()

表2 卵巢癌及其癌旁组织中p-PI3K、p-AKT 的表达情况比较()

注：与癌旁组织比较,aP<0.05

2.3 卵巢癌组织中REG3A 与 p-PI3K、p-AKT 的相关性分析 REG3A 阳性表达的卵巢癌组织中p-PI3K、p-AKT 水平明显高于REG3A 阴性表达的卵巢癌组织,差异具有统计学意义 (P<0.05)。相关性分析显示：REG3A 表达水平与 p-PI3K、p-AKT 表达水平呈正相关(r=0.387、0.426,P<0.05)。见表3,表4。

表3 REG3A 阳性与阴性表达的卵巢癌组织中p-PI3K、p-AKT 水平比较()

表3 REG3A 阳性与阴性表达的卵巢癌组织中p-PI3K、p-AKT 水平比较()

注：与阴性表达比较,aP<0.05

表4 卵巢癌组织中REG3A 与 p-PI3K、p-AKT 的相关性分析

2.4 卵巢癌细胞中敲减REG3A 和过表达REG3A情况分析 在卵巢癌细胞中敲减REG3A 和过表达REG3A,研究其对卵巢癌细胞增殖和细胞克隆的影响,发现敲减REG3A 抑制细胞增殖和克隆形成能力,过表达REG3A 促进卵巢癌细胞增殖和克隆形成能力。见图3。

图3 卵巢癌细胞中敲减REG3A 和过表达REG3A 情况

3 讨论

研究报道指出,我国卵巢癌的发病率高达5.21%,已成为威胁女性生命健康的五大恶性肿瘤之一。由于卵巢癌早期无典型症状,在经发现之后,有近70%的患者已发展至晚期［4］。因此,如何实现科学准确的诊断,以及对癌症进展、预后等的科学评估分析,对于卵巢癌治疗具有重要意义。近年来,随着对卵巢癌研究的不断深入,关于卵巢癌的发生机制有了更多研究结论,特别是卵巢癌的发生与PI3K/AKT 信号途径有密切关联,对于更加深入研究卵巢癌具有重要的指导性价值。REG 为钙依赖性植物凝集素超家族,可分为4 个亚型(1、2、3、4),其具有相似的基因结构,其中REG3 基因有REG3A、REG3b 和REG3g 三个亚基。人REG3A 与小鼠REG3g 同源性最高,两者均有调控细胞凋亡,细胞增殖,免疫应激等能力。有研究报道指出,REG3A 在肝癌、肠癌、卵巢癌等消化道癌症中都存在异常表达,REG3A 过表达通过激活AKT 和ERK1/2途径,以促进卵巢癌的发生及发展［5］。因此,从现有相关研究可见,REG3A 的表达水平情况,可以为临床卵巢癌的发展分析提供依据,同时也可以基于AKT 和ERK1/2 的通路研究,为卵巢癌的治疗提供新的思路与方案,具有重要的研究价值。

本文研究结果显示,卵巢癌组织中REG3A 阳性率、REG3A mRNA 表达水平均明显高于癌旁组织,差异具有统计学意义 (P<0.05)。研究提示,卵巢癌组织中REG3A 的表达水平更高,这表明卵巢癌的发生与发展与REG3A 的表达有相关性。为进一步了解REG3A 的作用机理,对下游p-PI3K、p-AKT 通路的激活进行了探究。本文研究结果显示,REG3A 阳性表达的卵巢癌组织中p-PI3K、p-AKT 水平明显高于REG3A 阴性表达的卵巢癌组织,差异具有统计学意义 (P<0.05)。表明卵巢癌细胞REG3A 与PI3K/AKT 通路的表达是促进卵巢癌发生及发展的重要因素,并且在对相关性的分析中得出,REG3A 表达水平与 p-PI3K、p-AKT 表达水平呈正相关(r=0.387、0.426,P<0.05)。REG3A 的表达显著增加,REG3A 过表达能够激活JAK2/STAT3 通路中JAK2 和STAT3 蛋白的磷酸化,促进卵巢癌细胞的增殖、迁移、侵袭和粘附,REG3A 可能是卵巢癌的潜在治疗靶点［6］。因此,针对卵巢癌细胞的增殖机理,通过对REG3A 过表达状态下激活 JAK2/STAT3 的情形,可以基于REG3A 过表达的有效抑制,以实现对卵巢癌的有效治疗,同时也可基于REG3A 的表达情况,对患者的病情程度进行评价分析,为治疗提供科学依据。

在卵巢癌细胞中敲减REG3A 和过表达REG3A,研究其对卵巢癌细胞增殖和细胞克隆的影响,发现敲减REG3A 抑制细胞增殖和克隆形成能力,过表达REG3A促进卵巢癌细胞增殖和克隆形成能力［7］。说明在卵巢癌发展中,REG3A 起到了重要的促进作用。通过对REG3A 过表达状态的有效敲减,可对卵巢癌的分期发展及预后,具有重要的意义,为临床卵巢癌诊治提供了新的思路。过表达REG3A 与分化差、肿瘤分期高、生存率低有关,通过REG3A 表达水平的抑制,可减轻REG3A 与PI3K/AKT 通路的激活程度,可为临床治疗提供良好调减［8,9］。特别是对于晚期卵巢癌患者,已措施最佳的手术等治疗时间,通过对REG3A 与PI3K/AKT 通路的抑制,可以成为临床治疗的新思路。此外,通过REG3A 表达水平,对患者癌症分期、发展等进行评估,也可以预后治疗提供依据。目前,卵巢癌已成为危害女性生命健康的常见恶性肿瘤之一,通过对REG3A 与PI3K/AKT 通路的抑制,可以从卵巢癌的治疗及抑制等维度,提高卵巢癌的治疗效果,成为当前卵巢癌临床研究的重要内容及方向。

综上所述,REG3A 在卵巢癌中高表达,并且预后不良,其能通过促进PI3K/AKT 通路的磷酸化促进卵巢癌细胞的增殖、侵袭、迁移和药物抵抗能力。卵巢癌组织中REG3A 表达水平的升高与p-PI3K、p-AKT 的激活、癌症分期进展等有关。通过分析临床数据,结合细胞生物学实验和分子生物学实验明确REG3A 对卵巢癌细胞恶性肿瘤学表型的影响,并研究其潜在的分子调控机制,通过动物水平的裸鼠荷载瘤实验研究REG3A 对肿瘤生长的影响,以期为探究卵巢癌的发病机制和寻找卵巢癌的药物治疗靶点提供新思路。