缺氧条件下HIF-1α/ROS 对肺癌A549 细胞凋亡和侵袭的作用及其机制

黄 波, 丁 洁, 郭红荣, 王红娟, 徐建群, 郑 泉

（1.湖北省武汉市第三医院 武汉大学附属同仁医院呼吸与危重症医学科，湖北 武汉 430070；2.湖北省武汉市第三医院 武汉大学附属同仁医院血液透析室，湖北 武汉 430070）

肺癌是癌症相关死亡的主要原因，其中非小细胞肺癌发病率约占全部肺癌发病率的85%。肺癌具有较高的死亡率和发病率，因此其早期诊断十分重要［1-2］。随着人们生活方式的改变和社会经济的发展，肺癌的发病率逐年升高，给人类健康造成极大威胁［3］。以顺铂为基础的化疗是目前治疗肺癌的主要方法，但化疗药物缺乏特异性且具有明显不良反应，因此寻找新的靶点对肺癌诊断和治疗具有重要意义［4］。

研究［5］表明：缺氧诱导因子1α （hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α）在肺癌患者血清中的表达明显上调。常氧条件下，HIF-1α 表达的蛋白会被迅速降解，而缺氧条件下降解途径被破坏，肿瘤细胞中的HIF-1α 通过调控糖酵解途径相关酶的表达促进葡萄糖代谢为乳酸，使HIF-1α 能够在缺氧环境中生存［6］。自噬在人类肿瘤等疾病的过程中发挥关键作用［7］。缺氧条件下，活性氧（reactive oxygen species，ROS）和HIF-1α 均可诱导自噬，并影响肿瘤的进展［8-9］，但在肺癌中的具体作用机制尚不明确。因此，本研究以A549 细胞作为研究对象，构建缺氧细胞模型，探讨HIF-1α 和ROS 的相互作用及其对A549 缺氧细胞模型自噬及生物学行为的影响，为肺癌的靶点治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器人非小细胞肺癌A549 细胞购于中科院细胞库。HIF-1α 抑制剂利非西呱（lificiguat，YC-1）和ROS 抑制剂N-乙酰半胱氨酸（N-acetylcysteine，NAC）购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，F12K 和胎牛血清购于美国Gibco 公司，CCK-8 试剂、抗荧光衰减封片剂、结晶紫和BCA 蛋白浓度测定试剂盒购于北京索莱宝科技有限公司，TRIzol 试剂购于美国Ambion 公司，SYBR FAST qPCR Master Mix 购于美国KAPA Biosystems 公司，反转录试剂盒购于日本TaKaRa 公司，ROS 检测试剂盒购于上海碧云天生物技术有限公司，荧光集团488 标记的羊抗兔抗体、微管相关蛋白轻链 3 Ⅱ（microtubuleassociated protein light chain 3-Ⅱ，LC3-Ⅱ）、HIF-1α 和人甲酰肽受体1 （formy peptide receptor，FPR1）抗体购于武汉贝茵莱生物科技有限公司，AnnexinⅤ-FITC/PI 凋亡检测试剂盒和Matrigel 购于美国BD 公司，PVDF 转移膜和化学发光试剂购于美国Millipore 公司。CO2恒温培养箱（311）和直热式CO2三气培养箱（FormaTM8000）购于美国Thermo 公司，倒置荧光显微镜（DMIL LED）和切片机（S6E）购于德国Leica 公司，PCR 仪（GE48527）购于杭州柏恒科技有限公司，实时荧光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）仪（CFX-Connect 96）和电泳仪（mini protean 3 cell）购于美国Bio-Rad 公司，超微量分光光度计（Nano-300）购于杭州奥盛仪器有限公司，流式细胞仪（NovoCyte）购于杭州艾森生物有限公司，透射电镜（HT7700）购于日本日立公司，酶标仪（MK3）购于芬兰雷勃公司，全自动化学发光分析仪（Tanon-5200）购于上海天能科技有限公司。

1.2 细胞培养和缺氧细胞模型构建采用含10%胎牛血清的F-12K 培养基于37 ℃、5% CO2条件下培养A549 细胞，细胞汇合度达80%时，按1∶2 比例进行传代。收集细胞，调整细胞悬液浓度，接种于6 孔细胞培养板中，每孔5×105个细胞，每孔2 mL，置于37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，取对数生长期的细胞，更换无血清培养液培养12 h，使细胞周期同步化，将细胞置于含94% N2、1% O2和5% CO2混合气体的缺氧培养箱中培养12、24、48 和72 h，收集细胞进行后续检测［10］。

1.3 模型鉴定以常氧培养（21% O2）的A549细胞作为对照，RT-qPCR 法检测不同处理时间细胞中HIF-1α mRNA 表达水平，TRIzol 法提取细胞总RNA，按照逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA，RT-qPCR 法检测细胞中HIF-1α mRNA 表达水平。引物序列：HIF-1α F 5′-GAAGTGTACCCTAACTAGCCG-3′，HIF-1α R 5′-TCACAAATCAGCACCAAGC-3′；GAPDH F 5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′，GAPDH R 5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3′。以GAPDH 为内参，采用2－△△Ct法计算HIF-1α mRNA 表达水平。取出细胞培养板，每孔加入10 μL CCK-8溶液，培养4 h，酶标仪检测波长450 nm 处各孔吸光度（A）值，以A值代表细胞增殖能力，实验重复3 次。缺氧条件下细胞增殖能力较好，HIF-1α 高表达表明缺氧诱导细胞模型构建成功，并由此确定最佳诱导时间。

1.4 细胞分组和处理将A549 细胞分为对照组、模型组、NAC 组、NAC+YC-1 组和YC-1 组。对照组细胞在常氧（21% O2）条件下培养，其余4 组细胞均按照“1.3”步骤中方法诱导24 h；模型组只进行缺氧诱导，不做其他处理；NAC 组缺氧诱导后采用20 mmol·L－1NAC 诱导24 h［8］；NAC+YC-1 组缺氧诱导后采用20 mmol·L－1NAC 和100 μmol·L－1YC-1 诱导24 h［11］；YC-1 组缺氧诱导后采用100 μmol·L－1YC-1 诱导24 h。干预完成后，进行后续实验。

1.5 RT-qPCR 法和Western blotting 法检测各组细胞中HIF-1α 和FPR1 mRNA 及蛋白表达水平

收集细胞，TRIzol 法提取细胞总RNA，RT-qPCR 法检测各组细胞中HIF-1α 和FPR1 mRNA 表达水平。引物序列：HIF-1α 上游引物，5′-TGCTTGGTGCTGATTTGTG-3′，HIF-1α 下游引物，5′-TGTCCTGTGGTGACTTGTCC-3′；FPR1 上游引物，5′-GTCGCAGCAGCCTTTTTT-3′，FPR1 下游引物，5′-CCAGGGCACTTGTCACATC-3′；GAPDH 上游引物，5′-GGGAAACTGTGGCGTGAT-3′，GAPDH 下游引物，5′-GAGTGGGTGTCGCTGTTGA-3′。以GAPDH 为内参，采用2－△△Ct法计算各组细胞中HIF-1α 和FPR1 mRNA 表达水平。同时提取细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白含量，Western blotting 法检测各组细胞中HIF-1α 和FPR1 蛋白表达水平，采用Image J 软件分析蛋白条带灰度值，实验重复3 次，以GAPDH 为内参，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

1.6 流式细胞术检测各组细胞中ROS 水平采用无血清培养液按照1∶1 000 的比例稀释DCFHDA，使终浓度为10 μmol·L－1。采用1 mL 稀释的DCFH-DA 重悬细胞，使细胞浓度为1×106mL－1，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱内孵育20 min，使探针和细胞充分接触。无血清细胞培养液洗涤3 次，收集细胞并用500 μL PBS 缓冲液重悬，采用流式细胞仪检测荧光强度。以荧光强度表示各组细胞中ROS 水平。

1.7 透射电镜观察各组细胞自噬体结构取1×107个细胞，采用2.5%戊二醛4 ℃预固定30 min 以上，PBS 缓冲液洗涤3 次，1% 锇酸后固定1 h，PBS 缓冲液洗涤3 次后进行梯度脱水，丙酮和环氧树脂812 按照1∶1 的比例40 ℃半浸透6 h，纯环氧树脂40 ℃全浸透4 h，包埋板包埋，加入包埋剂，置于聚合包埋箱聚合，采用切片机进行超薄切片。醋酸铀避光染色20 min，双蒸水洗涤3 次，枸橼酸铅避光染色15 min，洗去多余铅液，吸干后透射电镜观察并拍照，实验重复3 次。

1.8 免疫荧光法检测各组细胞中LC3-Ⅱ表达情况

收集各组细胞接种于12 孔细胞培养板，加入1 mL 4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS 缓冲液洗涤2 次，加入1 mL 0.5%Triton X-100 室温通透30 min，PBS 缓冲液洗涤2 次，加入1 mL 5%BSA 37 ℃封闭1 h，弃封闭液，加入一抗稀释液，4 ℃孵育过夜，PBS 缓冲液洗涤后加入二抗稀释液，37 ℃孵育1 h，PBS 缓冲液洗涤后加入含DAPI 的抗荧光淬灭封片液，置于荧光显微镜下拍照并记录，实验重复3 次。

1.9 流式细胞术检测各组细胞凋亡率收集各组细胞，取1×106个培养基重悬的细胞，400 g、4 ℃离心5 min，弃上清，加入1 mL 预冷的PBS 缓冲液，混匀后弃上清，200 μL PBS 缓冲液重悬细胞，加入10 μL Annexin Ⅴ-FITC 和10 μL PI，混匀后4 ℃避光孵育30 min，加入300 μL PBS 缓冲液，采用流式细胞仪检测细胞凋亡率。细胞凋亡率=（右上象限凋亡细胞数+右下象限凋亡细胞数）/细胞总数×100%。

1.10 Transwell 小室实验检测各组侵袭细胞数

收集各组细胞，采用无血清培养基重悬细胞至1×105mL－1，稀释基质胶并铺在Transwell 小室中，干燥后取200 μL 细胞悬液接种于Transwell 小室中，下层24 孔细胞培养板中每孔加入0.75 mL含10% 胎牛血清培养液，培养24 h，加入4%多聚甲醛室温固定30 min，PBS 缓冲液洗涤，加入1 mL 0.5%结晶紫溶液，染色30 min，取出小室，用棉签擦去上层细胞，光学显微镜下观察并计数，采用Image J 软件计算各组侵袭细胞数，实验重复3 次。

1.11 统计学分析采用GraphPad Prism 8.0 统计软件进行统计学分析。不同处理时间各组细胞中HIF-1α 和FPR1 mRNA 表达水平，各组细胞中HIF-1α 和FPR1 蛋白表达水平，各组细胞中ROS水平，不同处理时间各组细胞增殖能力，各组细胞凋亡率和侵袭细胞数均符合正态分布且方差齐，以±s 表示，多组间样本均数比较采用单因素方差分析，组间样本均数两两比较采用LSD-t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 缺氧环境下A549 细胞HIF-1α mRNA 表达水平和增殖能力与0 h 比较，低氧诱导12、24、48和72 h 时，细胞中HIF-1α mRNA 表达水平明显升高（P＜0.05 或P＜0.01），随着A549 细胞在低氧环境中的时间延长，HIF-1α mRNA 表达水平升高。与对照组比较，低氧诱导24、48 和72 h 时，模型组细胞增殖能力明显升高（P＜0.01）。结合两部分结果确定低氧诱导时间为24 h。见图1 和2。

图1 缺氧条件下A549 细胞中HIF-1α mRNA 表达水平Fig.1 Expression levels of HIF-1α mRNA in A549 cells under hypoxia condition

图2 缺氧条件下A549 细胞增殖能力Fig.2 Proliferation activities of A549 cells under hypoxia condition

2.2 各组A549 细胞中HIF-1α 和FPR1 mRNA 及蛋白表达水平与对照组比较，模型组细胞中HIF-1α 和FPR1 mRNA 及蛋白表达水平均明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，NAC 组、NAC+YC-1 组和YC-1 组细胞中HIF-1α 和FPR1 mRNA及蛋白表达水平均明显降低（P＜0.01），其中NAC+YC-1 组细胞中HIF-1α 和FPR1 mRNA 表达水平最低。与NAC 组比较，NAC+YC-1 组细胞中HIF-1α 和FPR1 mRNA 及蛋白表达水平明显降低（P＜0.01）。见图3 和4。

图3 各组细胞中HIF-1α(A)和FPR1(B) mRNA 表达水平Fig.3 Expression levels of HIF-1α（A) and FPR1（B) mRNA in cells in various groups

图4 各组细胞中HIF-1α 和FPR1 蛋白表达电泳图（A）和直条图（B,C）Fig.4 Electrophoregram(A) and histograms(B,C) of expressions of HIF-1α and FPR1 proteins in cells in various groups

2.3 各组A549 细胞中ROS 水平与对照组比较，模型组细胞中ROS 水平明显升高（P＜0.01）。与模型组比较，NAC 组、NAC+YC-1 组和YC-1 组细胞中ROS 水平均明显降低（P＜0.01），其中NAC+YC-1 组细胞中ROS 水平最低。与NAC 组比较，NAC+YC-1 组细胞中ROS 水平明显降低（P＜0.01）。见图5 和6。

图5 流式细胞术检测各组细胞中ROS 水平Fig.5 ROS levels in cells in various groups detected by flow cytometry

图6 各组细胞中ROS 水平Fig.6 ROS levels in cells in various groups

2.4 各组A549 细胞自噬体超微结构对照组细胞中细胞器结构完整，未见自噬体结构；模型组细胞中可见大量自噬体，可见明显空泡，细胞中细胞器也被降解；与模型组比较，NAC组、NAC+YC-1 组和YC-1 组细胞中自噬体减少，其中NAC+YC-1 组细胞中自噬体最少。见图7。

图7 透射电镜观察各组细胞中自噬体超微结构（×12 000）Fig.7 Ultrastructures of autophagosomes in cells in various groups observed by transmission electron microscope(×12 000)

2.5 各组A549 细胞中LC3-Ⅱ表达情况与对照组比较，模型组细胞中LC3-Ⅱ表达强度明显增加。与模型组比较，NAC组、NAC+YC-1组和YC-1组细胞中LC3-Ⅱ表达明显减少，其中NAC+YC-1 组细胞中LC3-Ⅱ表达最少。见图8。

图8 免疫荧光法检测各组细胞中LC3-Ⅱ表达强度(×200)Fig.8 Expression intensities of LC3-Ⅱ in cells in various groups detected by immunofluorescence method(×200)

2.6 各组A549 细胞凋亡率与对照组比较，模型组细胞凋亡率明显降低（P＜0.01）。与模型组比较，NAC 组、NAC+YC-1 组和YC-1 组细胞凋亡率明显升高（P＜0.01），其中NAC+YC-1 组细胞凋亡率升高最明显。与NAC 组比较，NAC+YC-1 组细胞凋亡率明显升高（P＜0.01）。见图9 和10。

图9 流式细胞术检测各组细胞凋亡率Fig.9 Apoptotic rates of cells in various groups detected by flow cytometry

图10 各组细胞凋亡率Fig.10 Apoptotic rates of cells in various groups

2.7 各组A549 侵袭细胞数与对照组比较，模型组侵袭细胞数明显增加（P＜0.01）。与模型组比较，NAC 组、NAC+YC-1 组和YC-1 组侵袭细胞数均明显减少（P＜0.01），其中NAC+YC-1组侵袭细胞数减少最明显。与NAC组比较，NAC+YAC-1组侵袭细胞数明显减少（P＜0.01）。见图11和12。

图11 Transwell 小室实验检测各组细胞侵袭情况(结晶紫，×200)Fig.11 Invasion of cells in various groups detected by Transwell chamber assay (Crystal violet,×200)

图12 各组侵袭细胞数Fig.12 Numbers of invasion cells in various groups

3 讨 论

缺氧是肺癌患者肿瘤微环境的一个重要特征，肿瘤细胞缺氧时细胞代谢会发生改变，导致脂质积累，使肿瘤细胞免受氧化和内质网应激的影响，并能够促进肿瘤细胞的增殖［12-13］。研究［14］显示：HIF-1α 表达是缺氧的标志，HIF-1α 在维持缺氧状态下肿瘤细胞的增殖和浸润中发挥关键作用。本研究结果显示：A549 细胞在缺氧状态下的时间越长，HIF-1α mRNA 表达水平越高；肿瘤细胞增殖能力随着缺氧时间的延长而逐渐增加，提示缺氧细胞模型构建成功。

缺氧条件下细胞发生氧化应激，引起ROS 的过量合成［15］。本研究结果显示：NAC 与YC-1 效果相同，均能明显降低缺氧细胞模型中ROS 和HIF-1α 水平，且NAC 和YC-1 联合处理细胞时降低ROS 和HIF-1α 水平作用更明显，提示ROS 与HIF-1α 能够相互作用和影响。研究［16］表明：FPR1 与肺癌的发生发展有密切关联，FPR1 表达水平升高能够促进肺癌细胞的迁移和成瘤能力。本研究结果显示：NAC 和YC-1 均可下调FPR1 表达，表明ROS 和HIF-1α 可能通过调节FPR1 的表达来影响肺癌的发生发展。

自噬对于维持应激状态下细胞内稳态具有重要作用，已被证实为包括癌症在内的多种疾病的治疗和干预靶点［17-19］。研究［8-9，20-21］显示：缺氧可介导ROS 和HIF-1α 通过不同的途径促进结肠癌、胰腺癌、胃癌和肺癌等细胞的自噬，并影响肿瘤的发生发展。本研究结果显示：NAC 和YC-1 单独和联合应用均可改变A549 细胞中自噬体结构，并减少细胞器的损伤。微管相关蛋白轻链3（microtubuleassociated protein light chain 3，LC3）是最早被发现的自噬标志物，有LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ两种形式，其中LC3-Ⅱ水平与细胞中自噬体的数量呈正相关关系，是反映细胞自噬活性的重要指标［22-23］。NAC 和YC-1 处理后细胞中LC3-Ⅱ表达明显下调，且NAC 和YC-1 联合处理后LC3-Ⅱ表达最低，表明缺氧条件下抑制HIF-1α 和ROS 水平可抑制肺癌细胞的自噬。NAC 和YC-1 单独和联合处理均可提高缺氧肿瘤细胞凋亡率，并抑制细胞侵袭能力。

综上所述，缺氧条件下抑制HIF-1α/ROS 可通过抑制肺癌细胞自噬促进肿瘤细胞凋亡，并抑制细胞侵袭，进而影响肿瘤的发生发展。