沉默CD147 对前列腺癌LNCaP 细胞糖酵解的影响

张斯琦, 孙美琪, 李泽颢, 刘丹丹, 胡 城, 方 芳, 王国庆

（1.北华大学医学技术学院临床生化检验教研室，吉林 吉林 132013；2.吉林医药学院检验学院免疫学技术教研室，吉林 吉林 132013）

肿瘤细胞中的能量代谢与正常细胞不同，其倾向于进行活跃的葡萄糖摄取和有氧条件下的糖酵解，即Warburg 效应。研究［1］显示：糖酵解促进了肿瘤进展和不良预后。前列腺癌（prostate cancer，PCa）是全球男性发病率排名第二位的肿瘤，已经成为影响全球男性健康的主要原因之一［2］。肿瘤细胞具有独特的葡萄糖代谢特点，在PCa 细胞移植瘤模型中，药物联合靶向Warburg 效应和自噬导致肿瘤消退［3］。CD147 是免疫球蛋白超家族Ⅰ型跨膜糖蛋白，在多种癌细胞中高表达［4］。PCa 发展与CD147 表达密切相关［5］。研究［6］表明：在胰腺导管腺癌细胞中，低表达CD147 可降低丙酮酸激酶M2（pyruvate kinase M2，PKM2）蛋白表达水平进而抑制糖酵解作用。在肝星状细胞中，低表达的CD147 抑制糖酵解相关蛋白乳酸脱氢酶（lactic dehydrogenase，LDH）活性和己糖激酶（hexokinase，HK）2 及葡萄糖转运蛋白1（glucose transporter 1，Glut1）的表达［7］。CD147 可通过多种方式调节肿瘤细胞的糖酵解作用。但CD147 对PCa 细胞糖酵解的作用及其机制尚未完全阐明。因此，本研究通过构建低表达CD147 的PCa 细胞系LNCaP，分析糖酵解中的产物及催化糖酵解限速酶的活性，探讨CD147 对PCa 细胞糖酵解的影响，为PCa 临床诊断和治疗提供新的分子标志物及其靶点。

1 材料及方法

1.1 细胞、主要试剂和仪器LNCaP/shCD147 细胞和阴性对照LNCaP/scramble 细胞由本实验室保存［8］。RPMI-1640、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS）、胰酶和青-链霉素双抗购自美国Gibco 公司，反转录试剂盒和实时荧光定量PCR （real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）试剂盒购自美国Gene Copoeia 公司，PCR 引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，β-actin、CD147、PKM2、HK2 和 肌 肉 磷 酸 果 糖 激 酶（phosphofructokinase of muscle，PFKM）抗体购自美国Signalway Antibody 公司，BCA 蛋白浓度检测试剂盒购自沈阳万类生物科技有限公司，丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PK）活性、HK 活性、6-磷酸果糖激酶1（6-phosphofructokinase 1，PFK1）活性检测试剂盒和总RNA 提取试剂盒购自北京索莱宝公司，腺嘌呤核苷三磷酸 （adenosine triphosphate，ATP）试剂盒购自美国Biovision 公司，乳酸（lactic acid，LA）和丙酮酸（pyruvic acid，PA）试剂盒购自上海酶联生物公司。凝胶成像仪购自美国Bio-Rad 公司，多功能荧光酶标仪购自德国BMG 公司，掌上离心机购自美国Scilogex 公司，RT-qPCR仪购自美国Applied Biosystems公司。

1.2 细胞培养和分组利用慢病毒感染系统建立沉默CD147 的LNCaP/shCD147 细胞作为LNCaP/shCD147 组，同时将LNCaP/scramble 细胞作为阴性对照组（LNCaP/scramble 组），采用含10%FBS和青-链霉素双抗的RPMI-1640 培养基孵育细胞，并置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，隔日换液。

1.3 RT-qPCR 法检测2 组LNCaP 细胞中CD147 mRNA 表达水平收集LNCaP/scramble 组和LNCaP/shCD147 组各细胞样本，采用TRIzol 法提取各样本中总RNA，NaNoDroP 2000 仪器检测总RNA 浓度和纯度，取1 μg 总 RNA 采用逆转录试剂盒合成cDNA，以cDNA 为模板，β-actin 为内参，进行RT-qPCR 反应。引物序列：β -actin上游引物5′-CACTGTGCCCATCTACGAGG-3′，β-actin 下游引物5′-TAATGTCACGCACGATTTCC-3′；CD147 上游引物5′-CAGAGTGAAGGCTGTGAAGTCG-3′，CD147 下游引物5′-TGCGAGGAACTCACGAAGAA-3′。反应条件：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性 15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40 个循环。采用2－ΔΔCt法计算目的基因表达水平。

1.4 2 组LNCaP 细胞培养上清液中LA 浓度检测收集LNCaP/scramble 组和LNCaP/shCD147 组细胞培养上清液，1 000 g 离心20 min 去除沉淀物，即刻检测。提前取出LA 试剂盒，平衡至室温，具体操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。于波长450 nm 处测定各孔吸光度（A）值，以A 值为横坐标，标准品浓度为纵坐标，绘制标准曲线并计算各样本浓度，样本浓度单位为mmol·L－1。

1.5 2 组LNCaP 细胞中PA 浓度检测收集LNCaP/scramble 组和LNCaP/shCD147 组细胞沉淀，PBS缓冲液重悬，超声裂解后600 g离心10 min。采用PA 试剂盒检测样本中PA 浓度，具体方法严格按照试剂盒操作要求进行。于波长450 nm 处测定各孔的A 值，以A 值为横坐标，标准品浓度为纵坐标，绘制标准曲线。根据标准曲线计算各样本浓度值，样本浓度单位为mg·g－1。

1.6 2 组LNCaP 细胞中ATP 浓度检测收集LNCaP/scramble 组和LNCaP/shCD147 组细胞，将细胞沉淀迅速匀浆于100 μL 的1×反应缓冲液中，16 000 g 离心30 s 去除碎片，将样本移入新EP管中备用。采用ATP 试剂盒对样本中ATP 浓度进行检测，具体操作步骤严格按照试剂盒要求进行，并计算ATP 浓度。ATP 浓度（mmol·L－1）=Sa·Sv－1。Sa 为标准曲线上的ATP 浓度，单位为mmol；Sv 为孔中加入的样本体积，单位为L。

1.7 2 组LNCaP 细胞中PK、PFK1 和HK 酶活性

收集LNCaP/scramble组和LNCaP/shCD147 组5×106个细胞，加入1 mL 蛋白提取液，冰浴条件下超声波破碎，4 ℃条件下8 000 g 离心10 min，取上清，置于冰上待测。采用BCA 试剂盒测定蛋白浓度，绘制标准曲线，根据标准曲线计算各样本蛋白浓度。采用试剂盒检测2 组LNCaP 细胞中酶活性，分别按照PK、PFK1 和HK 酶活性测定说明书进行，分光光度计测定各组A 值，计算PK、PFK1 和HK 酶活性。PK 酶活性（U·mg－1）=2 613×ΔA/样本蛋白浓度（g·L－1）；PFK1 酶活性（U·mg－1）=450×ΔA/样本蛋白浓度（g·L－1）；HK 酶活性（U·mg－1）=1 113×ΔA/样本蛋白浓度（g·L－1）；ΔA=初始A 值－定时测定A 值。

1.8 Western blotting 法检测2 组LNCaP 细胞中CD147、HK2、PFKM 和PKM2 蛋白表达水平收集LNCaP/scramble 组和LNCaP/shCD147 组细胞样本，无菌PBS 缓冲液清洗3 次，RIPA 细胞裂解液4 ℃裂解10 min，12 000 r·min－1离心10 min，取上清液，对蛋白浓度进行定量，加入上样缓冲液，100 ℃煮沸8 min。10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳中每个泳道加入30 μg 总蛋白电泳分离，转印至PVDF 膜上，5%脱脂奶粉室温封闭2 h，采用1×TBST 洗膜液洗膜3 次，每次10 min。分别加入β-actin、CD147、PKM2、PFKM 和HK2 抗体（1∶1 000），4 ℃孵育过夜；1×TBST 洗膜液洗膜3 次，每次10 min，二抗浓度为1∶5 000，室温孵育2 h，1×TBST 洗膜液洗膜3 次，每次10 min；ECL 化学发光液显影，采用Image J 1.8.0 软件分析蛋白条带灰度值，以β-actin 为内参，计算目的蛋白表达水平。目的蛋白表达水平＝目的蛋白条带灰度值/ β-actin 蛋白条带灰度值。

1.9 统计学分析采用SPSS 20.0 统计软件进行统计学分析。2 组LNCaP 细胞中CD147 mRNA 和蛋白表达水平，PA、LA 和ATP 浓度，PK、PFK1和HK 酶活性，HK2、PFKM 和PKM2 蛋白表达水平均符合正态分布，以±s 表示，组间样本均数两两比较采用独立样本t检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 2 组LNCaP 细胞中CD147 mRNA 和蛋白表达水平与LNCaP/scramble 组比较，LNCaP/shCD147 组细胞中CD147 mRNA 表达水平明显降低 （P＜0.01）。与 LNCaP/scramble 组比较，LNCaP/shCD147 组细胞中CD147 蛋白表达水平明显降低（P＜0.01）。见图1 和2。

图1 2 组LNCaP 细胞中CD147 mRNA 表达水平Fig.1 Expression levels of CD147 mRNA in LNCaP cells in two groups

图2 2 组LNCaP 细胞中CD147 蛋白表达电泳图（A）和直条图（B）Fig.2 Electrophoregram (A) and histogram (B) of CD147protein in LNCaP cells in two groups

2.2 2 组LNCaP 细胞中LA、PA 和ATP 浓度与LNCaP/scramble 组比较，LNCaP/shCD147 组细胞中LA 浓度明显降低（P＜0.01），PA 浓度和ATP浓度降低（P＜0.05）。见表1。

表1 2 组LNCaP 细胞中LA、PA 和ATP 浓度Tab.1 Concentrations of LA, PA, and ATP in LNCaP cells in two groups (n=3，±s）

表1 2 组LNCaP 细胞中LA、PA 和ATP 浓度Tab.1 Concentrations of LA, PA, and ATP in LNCaP cells in two groups (n=3，±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with LNCaP/scramble group.

Group LA[cB/(mmol·L－1)]PA[wB/(mg·g－1)]ATP[cB/(mmol·L－1)]10.34±1.60 5.99±0.82*LNCaP/scramble LNCaP/shCD147 0.91±0.12 0.51±0.07**4.41±0.76 2.82±0.42*

2.3 2 组LNCaP 细胞中PK、PFK1 和HK 酶活性与LNCaP/scramble 组比较，LNCaP/shCD147 组细胞中PK 酶活性降低（P＜0.05），PFK1 和HK酶活性明显降低（P＜0.01）。见表2。

表2 2 组LNCaP 细胞中PK、PFK1 和HK 酶活性Tab.2 Activities of PK, PFK1, and HK enzymes in LNCaP cells in two groups (n=3，±s）

表2 2 组LNCaP 细胞中PK、PFK1 和HK 酶活性Tab.2 Activities of PK, PFK1, and HK enzymes in LNCaP cells in two groups (n=3，±s）

*P＜0.05，**P＜0.01 compared with LNCaP/scramble group.

Group LNCaP/scramble LNCaP/shCD147 HK 5.07±0.57 2.23±0.37**PK 4.68±0.52 2.19±0.23*PFK1 10.43±1.24 4.20±0.69**

2.4 2 组LNCaP 细胞中HK2、PKM2 和PFKM 蛋白表达水平与 LNCaP/scramble 组 比 较，LNCaP/shCD147 组细胞中HK2 蛋白表达水平明显降低（P＜0.01），PKM2 和PFKM 蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

图3 2 组LNCaP 细胞中HK2、PKM2 和PFKM 蛋白表达电泳图（A）和直条图（B）Fig.3 Electropherogram (A) and histogram (B) expressions of HK2, PKM2, and PFKM proteins in LNCaP cells in two groups

3 讨 论

恶性肿瘤不仅存在基因异常，且通常发生代谢异常，尤其是能量代谢异常［9］。糖酵解是指在无氧或缺氧条件下，细胞内葡萄糖被分解成为PA，不再进行三羧酸循环，而在细胞质中合成LA 的过程。研究［10］表明：糖酵解是为肿瘤细胞提供能量和维持其生长的重要机制。随着生活水平的提高，人口老龄化加快，PCa 发病率也逐年增加。因此，发现能够调节PCa 细胞中糖酵解过程的分子，对PCa 的治疗至关重要。

研究［11］显示：低表达CD147 可以抑制肝癌细胞的糖酵解水平。本研究结果表明：通过RNAi 干扰技术敲低LNCaP 细胞中CD147 的表达可以抑制细胞中糖酵解代谢产物PA、LA 和ATP 浓度，与相关研究结论一致［12］。研究［13］发现：糖酵解水平受其代谢酶的表达水平、表型差异和活性等调控，尤其是糖酵解代谢中HK、PFK1 和PK 限速酶，三者在调控肿瘤细胞的糖酵解代谢过程中起重要作用。糖酵解过程中的第1 个限速酶HK 可催化葡萄糖转化为葡萄糖-6-磷酸，包含HK1、HK2、HK3和HK4 共4 种亚型，其中HK2 在正常细胞中几乎不表达，是肿瘤细胞Warburg 效应的一个关键调节因子［14］。第2 个限速酶PFK1，催化6-磷酸果糖生成1，6-二磷酸果糖，包含PFKM、PFKP 及PFKL 3 种亚型。PFKM 的激活促进了肝癌细胞Warburg 效应和细胞增殖［15］。第3 个限速酶PK，将磷酸烯醇式PA 转化为PA，具有L、R、M1 和M2 共4 种亚型。在肺癌细胞中，沉默PKM2 可以抑制肺癌细胞的葡萄糖摄取和LA 生成率及细胞增殖能力，表明PKM2 的稳定表达是肺癌细胞产生Warburg 效应和细胞增殖所必需的［16］。研究［6-7］显示：CD147 在肿瘤细胞中可以调节糖酵解，但在不同的肿瘤细胞中调节糖酵解的方式不一致。在胰腺导管腺癌细胞中，低表达CD147 降低PKM2 蛋白表达水平，进而抑制糖酵解作用；在肝星状细胞中，低表达CD147 抑制LDH 活性、HK2 和Glut1蛋白表达进而抑制糖酵解。本研究结果显示：在LNCaP 细胞中，CD147 主要通过调节PK、PFK1和HK 3 种限速酶活性及HK2 蛋白表达水平，从而调节糖酵解作用。

低表达CD147 对3 种限速酶活性均有抑制作用，但仅调节HK2 蛋白的表达，这可能是由于限速酶的活性是通过限速酶亚型的表达来维持的，也可能是酶激活翻译后修饰机制影响其酶活性［17-18］。综上所述，本研究探讨沉默CD147 对PCa 细胞糖酵解的作用，为进一步丰富CD147 介导糖代谢重编程的机制网络和寻找PCa 治疗的潜在靶点提供依据，提示CD147 具有作为PCa 治疗新靶点的潜能。