神经发育损害早产儿肠道菌群变化的前瞻性队列研究

李燕 陆斯良 莫艳 经连芳 姚丽平 谭伟 韦秋芬

（广西壮族自治区妇幼保健院新生儿医疗中心/广西儿科疾病临床医学研究中心，广西南宁 530003）

神经发育损害（neurodevelopmental impairment，NDI） 是一组由中枢神经系统（central nervous system，CNS）生长发育异常所导致的复杂疾病，包括运动、认知、语言发育迟缓等［1］。早产是导致NDI 的一个重要因素，胎龄越小NDI 发生率越高。本项目组前期多中心研究发现，广西地区胎龄＜28周早产儿NDI 的发病率高达35.9%［2］，形势严峻，但目前NDI 的治疗缺乏有效手段，仍以预防为主，严重影响着儿童的健康和生活质量，已成为广西地区新生儿科医师重点关注的一个临床问题。

肠道菌群被认为是人体的第二个基因组，已有研究证实了它与CNS 之间的潜在联系，二者可通过内分泌/神经、免疫和直接的神经作用进行双向“沟通”，即微生物-肠-脑轴［3］。在生命早期，肠道内的微生物对CNS 的发育至关重要，大脑内小胶质细胞的成熟、突触的发生、轴突的生长等过程都与肠道菌群关系密切［4］。与足月儿相比，早产儿肠道菌群多样性低、定植速度慢、成熟晚，易受外界因素影响，导致菌群的定植与发育模式发生改变［5-6］。现有的研究结果表明，精神分裂症谱系障碍（乳杆菌属等丰度增加）、孤独症谱系障碍（双歧杆菌属等丰度减少）及注意缺陷多动障碍（双歧杆菌属等丰度增加）等NDI的发生发展与早期肠道内菌群的失调相关联［7-9］，但受研究设计、样本数量及地域等因素的影响，此类的研究结果存在异质性。目前国内外关于NDI早产儿肠道微生物组特征的研究主要为横断面研究，难以系统地、详尽地了解菌群的演替过程，因此，为探索肠道菌群与疾病之间的关联性，纵向性的研究是必要的。

本研究采用了前瞻性、纵向、单中心队列的设计，收集多个时间点早产儿的粪便样本，应用高通量测序技术分析NDI与非NDI早产儿之间肠道菌群的差异，旨在丰富NDI早产儿肠道菌群结构的研究数据。本研究对揭示肠道菌群与早产儿NDI之间的联系，拓展早产儿NDI防治的新思路具有重要意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象及分组

本研究为前瞻性、纵向、单中心队列研究，选取2019年9月1日—2021年9月30日我院新生儿重症监护室（neonatal intensive care unit，NICU）收治的胎龄＜32 周且出生体重＜1 500 g 的早产儿为研究对象。在纠正胎龄1.5～2岁时行格塞尔发育量表评估，动作能、应物能、言语能、应人能任何一部分得分＜76分纳入NDI组，反之为正常组。本研究得到我院医学科研与临床试验伦理委员会批准（桂妇保院医伦快审2019-4号），新生儿父母或法定监护人知情同意。

纳入标准：（1）胎龄＜32 周，体重＜1 500 g；（2）生后立即转入NICU 治疗；（3）新生儿父母或法定监护人签署知情同意书。排除标准：（1）窒息或诊断为缺血缺氧性脑病；（2）中枢神经系统感染；（3）磁共振成像检查提示存在大脑发育异常或畸形；（4）遗传代谢性疾病；（5）急、慢性胆红素脑病；（6）明确头颅外伤；（7）自动出院或死亡。

1.2 一般资料采集

采用自制的广西胎龄＜32周早产儿病例资料收集表采集早产儿的相关资料，包括父母及新生儿出生基本信息、围生期情况、母亲孕期情况、疾病及诊治情况、出院及预后等。

1.3 粪便标本采集

采用一次性无菌粪便冻存管收集出院前1 d、辅食添加前1 d 及纠正胎龄1 岁3 个时间节点的粪便样本，在1.5 h内转移至-80℃保存待用。

1.4 样本DNA提取及测序

采用E.Z.N.A.®Soil DNA Kit（Omega Bio-Tek，Norcross，GA，U.S.）试剂盒提取DNA，NanoDrop 2000检测DNA浓度及纯度，-20℃保存备用。PCR扩增16S rRNA-V4 区，引物序列为338F （5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'） 和 806R （5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。PCR 产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测，AxyPrep DNA Gel Extraction Kit （Axygen Biosciences， Union City，CA，USA）进行回收产物纯化，检测定量后使用Illumina MiSeq PE300 平台上机测序，测序由上海美吉生物医药科技有限公司完成。

1.5 生物信息学分析

测序数据采用FLASH 软件将序列进行拼接，用Uparse 软件过滤嵌合体，获得优化数据后使用序列降噪方法（DADA2/Deblur 等）处理，获得扩增序列变体（amplicon sequence variant，ASV）代表序列和丰度信息，随后分析菌群多样性及组成。

1.6 统计学分析

使用SPSS 23.0 软件进行统计分析。正态分布的计量资料以均数±标准差（±s）表示，组间比较采用两样本t检验；非正态分布的计量资料以中位数（四分位数间距）［M（P25，P75）］表示，组间比较采用Mann-WhitneyU检验。计数资料采用例数和率或构成比（%）表示，组间比较采用χ2检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 一般情况

本研究共纳入455 例极低出生体重（very low birth weight，VLBW）早产儿，中途失访68例，随访387 例，排除粪便样本采集不全172 例，最终入组215 例，其中正常组115 例，NDI 组100 例。住院期间经磁共振成像检查，除NDI组的2例早产儿有少量脑实质出血，在随访期间出现脑软化外，其余早产儿均未见明显异常。两组早产儿性别、胎龄、出生体重、出生头围、出生身长等一般情况比较差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 两组早产儿一般情况比较

2.2 粪便样本收集及ASV分析

共收集粪便样本645 份，其中正常组在3 个时间点各115 份，NDI 组各100 份。两组早产儿在ASV水平上的Venn图结果如图1所示，整体上正常组所独有的ASV 数量更多，3 个时间点分别独有602、1 134、712 个物种，NDI 组则有613、595、544个物种，6个亚组所共有的物种数量为308个。

图1 两组早产儿在不同时间点的ASV 分类学水平物种Venn图 不同颜色代表不同的分组，重叠部分（白色）表示多个分组中共有的物种，未重叠的部分表示该分组特有的物种，数字表示对应的物种数目。M 表示正常组，N 表示NDI 组，数字1、2、3分别对应出院前1 d、辅食添加前1 d、纠正胎龄1岁。

2.3 物种多样性分析

2.3.1 α 多样性分析 NDI 组早产儿Shannon 多样性指数在纠正胎龄1岁时高于正常组（P＜0.05），见表2。

表2 两组早产儿Shannon多样性指数比较 （± s）

表2 两组早产儿Shannon多样性指数比较 （± s）

注：［NDI］神经发育损害。

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2.3.2 β多样性分析 主坐标分析（principal coordinates analysis，PCoA）显示，属水平上两组早产儿肠道菌群的组成在出院前1 d 时相似（R2=0.008，P=0.130）。至添加辅食前，菌群的结构出现差异，可在一定程度上区分两组样本（R2=0.035，P=0.001），其中PC1可解释24.51%的差异。在纠正胎龄1岁时，两组早产儿肠道菌群的组成已出现明显的差异（R2=0.022，P=0.003），在PCoA图中可区分大部分样本，其中PC1 可解释25.80%的差异。见图2。

图2 两组早产儿在3 个时间点的肠道菌群属水平PCoA 分析 A、B、C 图分别对应出院前1 d、添加辅食前1 d、纠正胎龄1岁，蓝色圆点表示正常组，红色三角形表示NDI组，每个小图形代表1个样本，置信椭圆水平为95%，横坐标表示主坐标成分1，纵坐标表示主坐标成分2，分析采用Bray-Curtis距离算法。

2.4 物种组成及差异分析

门水平上，两组早产儿均以放线菌门、变形菌门、厚壁菌门为主，占全部菌门的90%以上。在3个时间点上，正常组早产儿的优势菌门分别为变形菌门（49.21%）、厚壁菌门（33.96%）、放线菌门（38.72%）。NDI组早产儿除了出院前1 d以变形菌门（44.26%）为优势菌门外，其余时间点均以放线菌门（辅食添加前1 d：43.57%，纠正胎龄1岁：49.85%）为主，见图3A。

图3 两组早产儿菌群组成分布条形图 A图表示门水平分布条形图，B图表示属水平分布条形图，图例从上至下按照相对丰度由大到小排序，M 表示正常组，N 表示NDI 组，数字1、2、3 分别对应出院前1 d、辅食添加前1 d、纠正胎龄1岁，属水平上仅展示丰度排行前15的物种。

属水平上，正常组和NDI组早产儿各时点肠道内菌群主要由双歧杆菌属、大肠埃希菌属-志贺菌属、肠球菌属、克雷伯氏菌属、未分类肠杆菌属、链球菌属、狭义梭菌属1及乳杆菌属组成，多数以双歧杆菌为优势菌属。随着时间的增长，两组早产儿肠道内的双歧杆菌的丰度逐渐增加（正常组3个时间点分别为16.38%、26.07%、36.24%；NDI组分别为21.46%、40.97%、46.64%），一些条件致病菌如克雷伯氏菌、肠球菌的丰度则逐渐降低。见图3B。

NDI组肠道内双歧杆菌属丰度在3个时间点均高于正常组（出院前1 d：Z=-2.162，P=0.031；添加辅食前1 d：Z=-3.729，P＜0.001；纠正胎龄1岁：Z=-2.429，P=0.015），肠球菌属的丰度在辅食添加前1 d、纠正胎龄1 岁时也高于正常组（Z=-3.687，P＜0.001；Z=-2.782，P=0.005）。正常组3个时间点肠道内嗜黏蛋白阿克曼菌（以下称Akk菌）属的丰度分别为1.0%、3.6%、3.0%，NDI组分别为0.7%、0.5%、0.1%，在辅食添加前1 d时差异具有统计学意义（Z=-3.250，P=0.002）。见图4。

图4 两组早产儿各时点属水平群落组成差异柱状图 A、B、C图分别对应出院前1 d、添加辅食前1 d、纠正胎龄1岁，图中左半部分表示物种丰度占比，不同颜色代表不同分组，右半部分则表示两组相比物种丰度的差值，圆点颜色显示为物种丰度较大的分组。最右侧为P值，*0.01＜P≤0.05，**0.001＜P≤0.01，***P≤0.001。

以属水平的角度进行线性判别分析（linear discriminant analysis，LDA），出院前1 d 时造成两组早产儿肠道菌群结构存在差异的主要菌属为双歧杆菌属（LDA=4.57）、皮杆菌属（LDA=4.24）及难辨梭菌属（LDA=4.32）；添加辅食前1 d 为Akk菌属（LDA=4.20）、双歧杆菌属（LDA=4.85）、肠球菌属（LDA=4.57）；纠正胎龄1 岁时为双歧杆菌属 （LDA=4.70）、 肠球菌属 （LDA=4.31）。见图5。

图5 两组早产儿各时点LDA判别柱形图 A、B、C图分别对应出院前1 d、添加辅食前1 d、纠正胎龄1岁，LDA阈值设定为LDA＞4，图中所展示的是差异有统计学意义的物种。

3 讨论

生命早期的1 000 d 是大脑发育的一个关键时期，抗生素的应用、饮食和环境等因素都有可能通过微生物-肠-脑轴的“沟通”间接影响这一过程［10-11］。本研究发现，NDI 组早产儿肠道菌群的Shannon 指数在纠正胎龄1 岁时显著高于正常组，但此时两组早产儿的肠道菌群仍处于发育阶段，菌群的多样性在接下来的时间里仍会发生明显变化［12］，因此还难以对NDI 早产儿菌群的多样性特征下定论。

门水平上，两组早产儿肠道内菌群主要由放线、变形、厚壁3 大菌门组成，这与LaTuga 等［13］的研究结果一致。正常情况下，人类肠道内最先定植的菌群通常为兼性厌氧菌，随着氧气的消耗，严格厌氧菌如拟杆菌等才得以大量定植，之后便逐渐成熟形成以厌氧菌为主导的菌群结构［14］，因此正常足月儿肠道内拟杆菌门通常占比较高，从这一角度来看，VLBW早产儿的肠道环境可能并不适合拟杆菌生存。从属水平上分析，两组早产儿肠道内检出8 种主要的核心菌属，与Seki 等［15］的研究结果相似。该团队还发现克雷伯氏菌在肠道中过度生长是脑损伤的一个高度预测因素，然而在本研究中并未发现这一现象，且两组早产儿克雷伯氏菌在任一时间点相比差异均无统计学意义，其可能的原因是医疗环境等因素的影响。两组早产儿对比后发现，NDI组肠道内双歧杆菌属丰度在3个时间点均显著高于正常组，一些条件致病菌如肠球菌属丰度也显著增加。此外，PCoA分析显示，出院前1 d两组早产儿肠道菌群结构相似，出院后由于接触了复杂的自然环境，菌群组成差异便可明显区分开来，以上结果表明两组早产儿肠道菌群可能存在着不同的定植和发育模式。

值得注意的是，本研究中两组早产儿都出现了以双歧杆菌为优势菌属的结构，这可能是因为NICU 内广谱抗生素和益生菌的应用。VLBW 早产儿因其免疫系统发育相对不成熟，易并发各种感染，NICU 内应用抗生素的现象十分常见，长期抗生素应用可导致肠道内物种数量及丰度显著下降，在此基础上应用益生菌，菌群将逐渐过渡并转变为以双歧杆菌为主导的结构，然而这种早期建立起来的菌种将在生命后期占据重要的生态位［16］，整个过程相当于“重塑”了菌群的组成。双歧杆菌对儿童肠道的健康和免疫系统十分重要，它有助于加强肠道屏障功能并可能通过调节神经活性物质发挥脑保护的作用［17-19］。Beghetti等［20］研究发现，VLBW早产儿出生后1个月肠道内双歧杆菌丰度的降低与远期NDI的发生存在关联，然而在本研究中早产儿肠道内双歧杆菌丰度的增高似乎不能预测或阻止NDI的发生，这可能与诊疗操作和观测时间点的不同有关，因此本研究还无法确定双歧杆菌在NDI中的作用。本研究还发现，NDI组早产儿肠道内Akk菌的丰度始终低于正常组，Akk菌是一种肠道共生菌，正常情况下在生后逐渐增加，在宿主平衡健康与疾病的过程中起着重要作用，已有研究证明了Akk 菌的缺乏与多种疾病如炎症、肥胖相关联，同时也包括了CNS 疾病［21］，证明了肠道内Akk菌与大脑之间的联系，而Akk菌是否在NDI的发生发展中起到了关键作用？还需要更深入的研究来证明。

综上，在纠正胎龄1岁时，NDI组早产儿肠道内菌群的多样性显著高于正常组；NDI组肠道内双歧杆菌属丰度在3 个时间点均显著高于正常组；Akk 菌属丰度均低于正常组，仅在添加辅食前1 d差异有统计学意义。此外，NDI组肠道内肠球菌属丰度在添加辅食前1 d 和纠正胎龄1 岁时显著高于正常组；造成两组早产儿菌群存在差异的主要菌属为双歧杆菌、Akk菌和肠球菌。总之，本研究结果表明NDI与非NDI早产儿肠道菌群的组成存在显著差异。本研究也存在一些局限性：首先，仅设计了3个粪便样本收集的时间点，无法更好地观察NDI早产儿肠道菌群的演替过程，未来应增加早期（如6 个月内）及纠正胎龄2、3 岁时等观察时间点；其次，VLBW早产儿个体间肠道菌群存在高度变异，本研究的样本量有限，菌群的多样性和构成分析可能存在偏倚，还有待后续更大规模的队列研究；最后，本研究仅为16S rRNA 的描述性研究，无法对肠道内菌群的代谢产物变化和相应的分子机制作出分析，这有待更深入的研究以揭示肠道菌群在NDI中的潜在作用。

利益冲突声明：所有作者均声明不存在利益冲突。