高效液相色谱法测定滇橄榄粉中槲皮素的含量

◎ 李惠娟，杨欣怡，王怡瑾，张 瑜，季树聪，孙岭明

（1.云南白药集团中药资源有限公司，云南 昆明 650500；2.云南白药集团文山七花有限责任公司，云南 文山 663099）

滇橄榄，又名云南滇橄榄，首载于《唐本草》，是大戟科落叶灌木或乔木植物的果实。该植物春季开花，花小，单生黄色，雌雄同株，其果实肉质，扁球形，熟时呈红色。滇橄榄主要分布于亚洲热带地区，是一种重要的药食两用植物资源。滇橄榄的果实富含多种营养成分，如脂肪、蛋白质、糖类、维生素和矿物质等，具有多种保健功效，如降血脂、抗氧化、抗炎、抗菌等。因此，滇橄榄被广泛应用于食品、保健品、药品等领域[1]。滇橄榄果实中含有黄酮类化合物，1994 年，日本学者用甲醇和水提取滇橄榄果实，从中得到槲皮素，山奈酚-3-O-葡萄糖甙(Kaempferol-3-0-glucoside)、槲皮素-3-O-葡萄糖甙 (Quercetin-3-0-glucoside)、无色飞燕草素leuco delphinidin。滇橄榄果汁风味独特，营养丰富，是一种非常有价值的水果，含有大量维生素C。由于黄酮和单宁类物质的作用，滇橄榄经加工后，其维生素C的保存率可以高达72%[2]。这些特点使滇橄榄成为一种非常有价值的水果，被广泛应用于食品、保健品、药品等领域。此外，滇橄榄还具有化痰止咳的功效、健胃消食，清热生津，保肝解毒等功效，主治感冒发热、咳嗽、咽喉痛、白喉、烦热口干、消化不良、腹痛、慢性肝炎、高血压病、肥胖症、高脂血症、热性水肿和尿频等，具有清热利咽、润肺化痰、生津止渴之功效。此外，现代研究表明，滇橄榄具有抗氧化、除自由基、抗肿瘤、防衰老等[3]。

滇橄榄粉由滇橄榄鲜果压榨取汁，加入一定量糊精，喷雾干燥而成，该制备方法已由丽江格林斯通食品有限公司申请获得专利，但该法所得产品（滇橄榄粉）质量标准较为简单，目前尚无含量测定项目。为了更好地控制该产品质量，本文对滇橄榄粉中的槲皮素含量进行了测定，并进行了相关方法考察。

以滇橄榄为原料的食品较多，主要有滇橄榄茶饮料、滇橄榄含片、滇橄榄果泥、滇橄榄果珍、滇橄榄果酒、滇橄榄保健茶、滇橄榄润喉糖等。其中以饮料居多，但是由于口感的原因，大多数人难以接受，故市场销售并不太好。当然，滇橄榄还可用于提取橄榄油。为更好地利用滇橄榄资源、开发口感较好食品，本文拟将其制成复方滇橄榄含片。

1 仪器与试药

1.1 仪器

BT25S型电子分析天平（上海精密仪器仪表有限公司）；高效液相色谱仪（Aglient 1100，四元泵，DAD检测器）；Agilent ZORBAX SB-C8色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，等。

1.2 试药

滇橄榄粉末，由丽江格林斯通食品有限公司提供；甲醇为液相使用色谱纯，其他试剂为分析纯。

1.3 标准物质对照品

含量测定对照品：槲皮素（对照品批号：100081-201610，中国食品药品生物制品检定研究院提供。）

2 方法和结果

2.1 色谱条件

Agilent ZORBAX SB-C8色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相：甲醇-0.05%磷酸溶液（45:55），八烷基键合硅胶为固定相 (4.6 mm×250 mm，5μm)，流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长为370 nm；理论板数≥4 000。

2.2 对照品溶液制备

槲皮素对照品：精密称取对照品适量，加乙醇使其溶解，制备成0.012 mg/ml对照品溶液。

2.3 供试品溶液制备

供试品制备：精密称定滇橄榄粉末约5.0 g，置100 ml锥形瓶中，精密加入2%盐酸-乙醇溶液50 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷至室温，再称定重量，补重用2%盐酸-乙醇溶液，摇匀，滤过。取续滤液，用0.45 μm滤膜滤过，即得。

2.4 检测波长的选择

通过槲皮素对照品的乙醇溶液光谱图（见图1），可以看出对照品在250 nm、370 nm处有较大吸收峰，故本次试验测定波长选取370 nm。

图1 槲皮素对照品溶液光谱图

图2 槲皮素对照品色谱图

2.5 系统适用性试验

根据相关文献[4]及预实验结果，选用甲醇-0.05%磷酸溶液（45:55）为流动相，用辛烷基键合硅胶为填充剂 (4.6 mm×250 mm，5 μm)，流速1.0 mL/min；柱温30 ℃；检测波长为370 nm；理论板数≥4 000。另取对照品溶液和供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪进行测定。测定结果见表1，色谱图见2和图3。

表1 系统适用性试验结果表

图3 滇橄榄粉供试品色谱图

结果表明：在上述色谱条件下，槲皮素峰的对称因子、分离度、理论塔板数均符合中国药典要求，可用于该物质的含量测定。

2.6 线性与范围

精密吸取槲皮素对照品溶液(0.01 mg/m1)1 μL、2 μL、5 μL、10 μL、15 μL、20 μL，分别注入高效液相色谱仪，参照上述色谱条件测定峰面积，详细结果见表2。以峰面积（A）为纵坐标，进样量（C）为横坐标，绘制标准曲线（见图4），并计算回归方程。结果槲皮素对照品的回归方程为A= 6 585.2C+4.668( r=0.999 9)，槲皮素在0.012 μg~0.24 μg范围内，峰面积与进样量有良好的线性关系。

表2 槲皮素对照品线性关系与范围的考察表

图4 槲皮素线性关系与范围考察图

2.7 供试品溶液提取水解条件考察

2.7.1 供试品溶液制备提取方法选择

参考相关文献[5]，拟订了两种方法。

方法一: 取滇橄榄粉末约5.0 g，精密称定，置锥形瓶中，加入甲醇250 mL，回流1.5 h，回收甲醇至干，残渣再精密加入5%盐酸-甲醇溶液50 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷至室温，再称定重量，补重用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过。取续滤液，过0.45 μm滤膜滤过，即得。

方法二：取滇橄榄粉末约5.0 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入5%盐酸-甲醇溶液50 mL，称定重量，加热回流1 h，放冷至室温，再称定重量，补重用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.45 μm滤膜滤过，即得。

按2.4项下色谱条件测定槲皮素含量，结果见表3。

表3 不同提取方法的比较表

结果表明，方法二处理的样品槲皮素含量更高，因此选用了方法二进行槲皮素的提取。

2.7.2 供试品溶液制备提取溶剂选择

精密称定滇橄榄粉末3份，每份约5.0 g，置于100 mL锥形瓶中，每份样品精密加入5%盐酸-甲醇溶液、5%盐酸-乙醇溶液、5%盐酸-50%乙醇溶液50 mL，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.4项下色谱条件测定槲皮素含量，结果见表4。

表4 不同提取溶剂的比较表

结果表明，以乙醇含量最高，因此，选用乙醇作为提取溶剂。

2.7.3 供试品溶液制备水解催化剂种类选择

精密称定滇橄榄粉末3份，每份约5.0 g，置于100 mL锥形瓶中，每份样品分别精密加入5%盐酸-乙醇溶液、2%硫酸-乙醇溶液、1%氢氧化钠-乙醇溶液50 mL，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.4项下色谱条件测定槲皮素含量，结果见表5。

表5 不同水解催化剂的比较表

结果表明，水解催化剂以盐酸为佳。

2.7.4 供试品溶液制备盐酸浓度选择

精密称定滇橄榄粉末3份，每份约5.0 g，置100 mL锥形瓶中，每份样品分别精密加入溶剂2%盐酸-乙醇溶液、5%盐酸-乙醇溶液、8%盐酸-乙醇溶液50 mL，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.4项下色谱条件，测定槲皮素含量，结果见表6。

表6 不同水解盐酸浓度的比较表

结果表明，三者含量接近，因此，选用的盐酸浓度为2%。

2.7.5 供试品溶液制备提取水解时间选择

精密称定滇橄榄粉末3份，每份约5.0 g，置于100 mL锥形瓶中，每份样品分别精密加入2%盐酸-乙醇溶液50 mL，称定重量，分别加热回流0.5 h、1 h、1.5 h，按2.3项下方法制备供试品溶液，按2.4项下色谱条件测定槲皮素含量，结果见表7。

表7 不同提取时间的比较表

结果表明，水解时间以1.0 h为佳。

2.8 稳定性试验

取滇橄榄粉末，按2.3项下方法制备供试品溶液，取供试品溶液于0 h、2h、4 h、6 h、 8 h、10 h进样10 μL，记录峰面积值。测得结果如表8。结果表明，溶液在10 h内稳定。

表8 稳定性试验结果表

2.9 重复性测试试验

精密称定同一批滇橄榄粉末6份，分别按含量测定方法项下列举的方法测定，计算出槲皮素含量，结果详见表9。数据结果表明，滇橄榄粉末样品平均含量0.192 mg/g，RSD值＜2%，证明考察方法重复性良好。

表9 重现性试验结果表

2.10 准确度试验

精密称取已知含量的滇橄榄粉末6份（槲皮素含量为0.192 mg/g），每份约2.5 g，精密称定，置圆底烧瓶中，精密加入槲皮素对照品溶液（槲皮素5.0 mg→100 mL乙醇溶液）10 mL，再精密补加2%盐酸-乙醇溶液40 mL，每份均按2.3项下方法供试品溶液制备方法制备成供试液，取10 μL注入液相色谱仪测定含量，计算回收率，结果见表10。

表10 加样回收率试验结果表

实验结果表明，6份样品的RSD值为0.89%＜2.0%，说明本实验方法稳定可行。

3 讨论

考虑到提取的简化和溶剂的节约问题，故在试验中采用了2.6.1中方法二的提取方法进行槲皮素的提取，通过试验数据证明，方法二中方案是可行的。

本实验中用到的滇橄榄粉是由丽江格林斯通食品有限公司提供，其制作方法由该公司申请过专利，但原标准中未对有效成分进行质量控制。因此，通过本方法可以对滇橄榄粉的质量进行有效控制。

在用槲皮素提取的过程中，用到了甲醇、乙醇为溶剂对滇橄榄粉进行提取，结果表明，乙醇的提取效果要比甲醇好，其原因可能是槲皮素在乙醇中有较大的溶解度，而甲醇对其的溶解性没有乙醇好。试验中，对水解酸碱度进行了验证，发现在碱性条件下，黄酮类化合物只有很小的一部分水解生成槲皮素，可能是在碱性条件下黄酮类化合物发生了开环，生成了其他化合物，或是生成了盐类化合物。通过实验得出，滇橄榄粉中槲皮素提取的最优方法是2%盐酸-乙醇溶液进行提取水解，水解时间为1 h。用该方法进行提取的槲皮素提取率较高、实验的准确性较高，并能保证在一定的误差范围内，有效控制滇橄榄粉的质量。