玉米种子纯度快速分子检测技术研究

胡昕

摘    要：种子纯度检测是产品质量检测的中心，检验种子纯度是促进农业发展和维护种业秩序的必经之路。随着信息化发展，种子纯度快速分子检测技术不断更新优化，如何使用现代化纯度快速分子检测技术验证玉米种子纯度是值得思考的问题。文章阐述了机器视觉技术、分子标记技术、DNA快速提取法，分析了玉米种子纯度快速分子检测技术应用方法，结合试验结果得出玉米种子纯度快速分子检测技术步骤以及梯度要求。

关键词：种子纯度；快速分子检测；检测技术

文章编号：1005-2690（2023）10-0031-03       中国图书分类号：S513       文献标志码：B

作者简介：胡 昕（1973—），男，汉族，山东济南人，硕士，高级农艺师，研究方向为农作物种子质量监测。

种子是农业发展的核心，是保证国家粮食安全、促进农业发展的重要因素之一。2020年中央经济工作会议提出要充分解决种子质量问题和耕地问题。基于指示精神，鉴定种子质量问题是保证农业生产的重要工作之一。新时代背景下，保证玉米种子纯度真实性是控制玉米种子质量的关键，如何借助现代化新农业技术和基因鉴定技术鉴定玉米种子纯度是核心问题之一。

文章分析了现代化新农业技术、种子纯度快速分子检测技术，结合玉米种子特性进行种子纯度快速分子检测试验，以期可以为促进农业发展贡献一份力量。

1 玉米种子纯度快速分子检测技术简述

1.1 机械视觉技术

机械视觉技术是一种包含了人工智能、神经生物学、自然科学、计算机技术、图片信息处理、模型认知等众多方面的高新技术[1]。该技术主要利用计算机模仿人类视觉功能，从客观的图象中抓取视觉感觉信号，经过计算机进行信息处理、分析，用于试验测试、试验控制。机械视觉技术的发展取代了人工观察测量方式，改善了投放于市场的产品质量，同时获取大量信息，并对信息进行自动化处理，可用于设计信息、信息集成、信息加工等[2]。因此，在自动化制造流程中，机械视觉技术可被广泛应用于工况监测、成品检验、品质管理等环节。

1.2 分子标记技术

理解分子标记技术概念需要从分子标记入手，广义的分子标记是指可遗传并可检测的DNA序列或蛋白质，狭义的分子标记是指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异的特异性DNA片段[3]。分子标记技术是检测分子DNA序列或蛋白质，并反映生物个体DNA组差异的技术。现阶段，分子标记技术主要分为随机引物PCR标记技术、特异引物PCR标记技术等。随机引物PCR标记技术试验选择的单核苷酸序列是随机的，但由于试验DNA范围不明，因此通过该方法在扩增的DNA范围上形成的多型性分子变化结果主要来自于模板DNA扩增范围上的融合部位的碱基顺序变化情况，该技术试验结果中显隐性差异体现了不同试验基因组所在区域的扩增查结果的差异。特异引物PCR标记技术根据试验中已知序列的DNA区段进行标记，可在常规PCR重复性温度下扩增，然后对试验的DNA特异区段进行多态化研究[4]。

1.3 DNA快速提取方法

传统DNA提取方法大多以种子幼芽或叶片为试验材料提取DNA，但是此类技术操作复杂，耗时长，极易交叉感染，污染试验环境，影响试验结果。基于此，此次试验在搜集对比了多种DNA快速提取方法后选择使用多重PCR技术。多重PCR又名多重引物PCR或复合PCR，指在一个常规PCR的反应系统内添加多对引物，扩增出多种扩增片段的PCR反应体系，其反应机理、反应试剂以及反应过程均与常规PCR基本相同。与传统DNA快速提取方法相比，多重PCR技术操作简单、试验高效，目前已被广泛应用于DNA检测领域。

2 玉米种子纯度快速分子检测技术应用

2.1 试验材料

玉米种子：100粒。缓冲液：0.5 mol / L NaCl、100 mol/L Tris-HCL（pH值8.0）、50 mol/L MEDTA、5％SDS、1％PVP（pH值8.0）、1×TE 缓冲液（Tris-EDTA）、1×TBE（Tris-硼酸）缓冲液、5×TBE（Tris-硼酸）缓冲液、TEMED（四甲基乙二胺）、Acr-Bis（丙烯酰胺＋甲叉丙烯酰胺复合液）、溴化乙锭（EB）。SDS 法提取液：酚氯仿異戊醇溶液、氯仿异戊醇溶液、异丙醇溶液、乙醇溶液等。电泳试剂：1.2％琼脂糖、9％PAGE（聚丙烯酰胺凝胶）。

2.2 试验设计

根据玉米种子纯度检测要求与玉米种子纯度快速分子检测技术功能对试验作出相应设计。此次试验主要使用DNA快速提取法、通用多重PCR技术。其中DNA快速提取法分为以下2种：一是参照CTAB法、SDS法提取试验样本；二是使用快速法提取试验样本DNA。完成DNA快速提取法后得出DNA浓度和完整性检测结果，使用通用多重PCR技术鉴定DNA因子并得出试验结果[5]。

2.3 试验方法

2.3.1 DNA快速提取法

1）SDS法提取DNA。将样本磨碎后称取0.1 g放入1.5 mL的离心管中，加入1 mL 65 ℃ DNA提取缓冲液后充分混合（缓冲液成分：0.5 mol NaCl、100 mol Tris-HCl pH值8.0、50 mol MEDTA、5％SDS、1％PVP）；室温下（26 ℃），1 000 g离心10 min，取上清1.5 mL溶液加入等体积酚氯仿异戊醇后充分混合；室温下（26 ℃），1 000 g离心10 min，取上清1.5 mL溶液加入等体积氯仿异戊醇后充分混合；室温下（26 ℃），1 000 g离心10 min，取上清1.5 mL溶液加入等体积异丙醇后充分混合；室温下（26 ℃），1 000 g离心10 min，取上清1.5 mL溶液加入15μL 70％乙醇清洗沉淀，清洗2次；除去乙醇容易，晾干沉淀；加50μL 1×TE缓冲液，溶解DNA后置于冷冻室保存，冷冻室温度为-20 ℃[6]。

2）CTAB法提取DNA，包括DNA完整性電泳检测与DNA质量PCR扩增检测。一是DNA完整性电泳检测。根据试验样本质量确定胶量，取1.2％琼脂糖，1×TBE作为溶剂，将溶液放置于微波炉中使其溶解后取出放凉。待溶液温度在60 ℃以下后加入适量EB，将胶倒至胶盒之中，待凝固后取出放入电泳槽；参照上述步骤进行浓度加样；用移液器将胶体加到样孔之中；接通电源，观察试验现象。二是DNA质量PCR扩增检测。从样本中筛选出多态性高、特异性好的样本，选取phi 0.6用于检测。随后PCR扩增检测采用20μL扩增体系，其中上下游引物各0.5μL；用9％聚丙烯酰胺凝胶溶液检测PCR扩增产物。

2.3.2 PAGE检测PCR扩增产物

完成DNA质量PCR扩增检测试验操作后需要使用PAGE检测样本PCR扩增产物，具体试验步骤如下。溶液配制（9％聚丙烯酰胺凝胶溶液），使用50 mL蒸馏水、20 mL 5×TBE、30 mL 30％Acr-Bis、750μL10％过硫酸铵、75μL四甲基乙二胺；将配制度完成的溶液灌入玻璃制胶板并观察是否有气泡产生，待溶液凝固后取出梳架，取出样孔内残留液体，待样孔干燥后放置于电泳槽上并注入1×TBE电极缓冲液；吸取2μL扩增产物于样孔内；用150 V电泳稳压至凝胶底部；电泳结束后取出凝胶，放置于去离子水中清洗，清洗完成后加入AgNO3溶液并进行3 min染色，染色完成后加入去离子水清洗，清洗完成后加入显影液，轻轻摇晃至条带清晰后即可进行清洗；完成清洗后进行读带，进而分析目标带情况。

2.4 试验结果

2.4.1 提取液浓度及体积对DNA提取质量的影响

本次试验分别取0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.20、0.30 mol/L 12个浓度梯度和200、400、600、800、1 000μL 5个体积梯度进行试验，分析试验结果。

1）对DNA完整性的影响。取10μL试验样本用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测样本DNA的完整性，得出提取液浓度及体积对玉米种子DNA提取质量的影响结果。从体积梯度分析，200μL体积和400μL体积的试验样本均呈现出明显、清晰的主带效果，但是400μL的主带效果图弱于200μL主带效果。相比之前，600μL的样品主带效果更弱，但是仍能观察到部分成像。800、1 000μL的样品主带效果几乎不明显。从浓度梯度分析，12个浓度梯度呈现呈“不明显—明显—不明显”的趋势，其中0.01 mol/L浓度梯度的成像效果几乎不明显，0.2 mol/L浓度梯度后的成像逐渐明显，0.05、0.06、0.07 mol/L浓度梯度的成像效果最为明显。综合提取液浓度和体积的成像结果，0.05～0.07 mol/L浓度梯度、200～600μL体积梯度为最佳提取液参数。

2）对PCR产物的影响。取试验样本2μL行PCR扩增，用9％ PAGE检测PCR扩增产物，验证提取液浓度和体积对玉米种子PCR产物的影响，得出试验结果效果。从浓度梯度分析，0.01、0.02 mol/L的样品有较弱的目标带成像，0.03、0.04、0.05 mol/L的样品有稍明显的目标带成像，0.06～0.20 mol/L有明显的目标带成像。从体积梯度分析，200～1 000μL溶液均有明显、清晰的目标带成像。因此，综合浓度梯度成像结果以及体积梯度成像结果得出，0.03～0.20 mol/L的浓度梯度、200～1 000μL体积梯度的溶液均满足PCR扩增要求。

2.4.2 提取时间对DNA提取质量的影响

根据提取液浓度和体积对玉米种子DNA完整性和PCR产物的影响结果，采用最佳提取液浓度梯度和最佳体积梯度试验，使用0.05 mol/L浓度梯度、500μL积梯度进行试验，在1、5、10、20、40、60、720、1 440、2 160、2 880、4 320 min观察后混合提取液，得出试验结果成像。

1）对DNA完整性的影响。取10μL试验样品用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测得出提取时间对DNA完整性有影响，得出提取时间对玉米种子DNA完整性的影响试验结果。1～20 min的样品成像较弱且差异变化不明显；40 min后亮度逐渐增加，各个梯度之间差异变化逐渐明显；60 min后样品有明显、清晰的成像带；60～2 880 min样品差异变化不明显；4 320 min的样品成像呈发亮状态。因此，综合成像结果，为了确保玉米种子DNA完整性，将提取时间控制在1～2 880 min为佳。

2）对PCR产物的影响。取2μL试验样品进行PCR扩增产物试验验证，用9％ PAGE检测PCR扩增产物，研究提取时间对PCR产物的影响，得出提取时间对玉米种子PCR产物的影响试验结果。样品提取时间在1～2 880 min成像不明显，各个区间差异变化不显著；样品提取时间在4 320 min后呈现出的成像带亮度开始减弱，逐渐趋近于无光亮状态。因此，综合成像结果，提取时间在1～2 880 min的玉米种子样本均可满足PCR扩增要求。

2.5 试验结论

在玉米种子纯度快速分子检测技术应用过程中，充分利用DNA快速提取法和PCR技术，综合2种技术的试验成像效果确定玉米种子纯度快速分子检测技术实施步骤如下。随机选取玉米种子样本，将玉米种子切样、取样后放置于离心管中，加入500μL积梯度、0.2 mol/L浓度梯度提取液；对样品加入PCR扩增提取液后混合样品，完整取样。每个样品取2μL于多重PCR扩增；采用多重通用PCR技术20μL增体系和9％ PAGE检测多重扩增产物，验证PCR扩增产物变化。

综合试验步骤、采样结果、试验结果得出，玉米种子纯度快速分子检测技术适用于玉米种子纯度检测，通用性良好、检测结果显著。

3 结束语

玉米种子纯度快速分子检测技术中机械视觉技术、分子标记技术、DNA快速提取法分别能够应用于玉米种子外观观察、DNA序列标记、DNA检测，是快速检测玉米种子纯度的重要技术。

此次试验主要综合DNA快速提取法和PCR扩增技术对玉米种子纯度进行检验，结合试验结果认为2种技术能够快速、有效验证玉米种子纯度。将2种技术综合应用于玉米种子纯度检测，能够有效提高玉米种子纯度鉴定效率，保障玉米种子真实性和纯度，助力农业生产、种业市场规范化、可持续发展。

参考文献：

[1]高振环.关于农作物种子检验与提高玉米种子质量的探究[J].农村实用技术，2022（5）：55-57.

[2]程莹，许亚男，侯浩楠，等.基于机器视觉技术的小粒中药材种子净度快速检测[J].中国农业大学学报，2022，27（5）：114-122.

[3]李肯，武云鹏，彭冬秀，等.利用SSR标记快速检测甜瓜“天美55”种子纯度与真实性[J].分子植物育种，2022，20（8）：2674-2681.

[4]王玉杰，冷春旭，孙中义，等.分子标记技术在农作物种子检测中的应用[J].中国种业，2022（3）：38-40.

[5]李儒剑，万吉丽，尹晓佳，等.SSR分子标记法快速进行常规稻种子纯度检测的研究及应用[J].杂交水稻，2022，37（3）：11-19.

[6]岳佳铭，丛晓翔，李曼莉.多光谱成像技术在种子质量检测研究中的应用[J].种子，2021，40（10）：129-135.