天南星多糖通过下调circ_0010235调控肺癌细胞s增殖、迁移和凋亡

仲川岳,吴雪元,朱红燕

(苏州市中西医结合医院肿瘤科,江苏 苏州 215000)

肺癌是世界上发病率和死亡率均最高的恶性肿瘤,尽管手术、放化疗等治疗策略等不断进展,但肺癌患者的整体生存率和预后仍较差[1]。中药可增强常规治疗的作用,减少不良反应和毒性,减轻患者疼痛,提高生活质量,是一种潜在有效的肺癌辅助治疗方法[2]。天南星是我国传统中药,其性味苦辛、温,归肺、肝经,具有燥湿化痰、消肿散结之功效[3]。天南星多糖是天南星的主要活性成分之一,已经证实其在S180荷瘤小鼠、肾癌、乳腺癌中的抗癌作用[4-6]。近期研究[7]显示,天南星提取物通过调控miR-320/E2F1抑制肺癌细胞增殖并促进凋亡。天南星提取物是天南星主要活性成分的集合物,故本研究推测天南星多糖同样具有抗肺癌作用,且可能与调控非编码RNA水平相关。环状RNA(circRNA)是一组具有闭环结构的非编码RNA,其通过circRNA/微小RNA(miRNA)/mRNA轴参与了肺癌的发生、侵袭和转移[8]。研究报道肺癌中circ_0010235表达增加,下调circ_0010235可抑制肺癌细胞增殖和自噬,诱导细胞凋亡,抑制肿瘤生长[9]。已有研究[10-11]表明,中药活性成分的抗肿瘤活性可能与非编码RNA的异常调控有关,如龙葵多糖通过调控circ_UHRF1/miR-513b-5p轴抑制肺癌A549细胞的增殖、迁移和侵袭,并诱导细胞凋亡[12];小蘖碱对子宫内膜癌生长的抑制作用与下调circ_ZNF608/miR-377-3p/COX2轴有关[13]。因此,本研究利用肺癌细胞A549研究天南星多糖的体外抗肺癌作用,并探讨天南星多糖与circ_0010235的调控作用。

1 材料和方法

1.1 实验材料

人肺癌细胞A549(美国ATCC);si-NC、si-circ_0010235、pcDNA、pcDNA-circ_0010235(南京金斯瑞生物公司);脂质体2000(美国Invitrogen公司);天南星药材由苏州市中西医结合医院中药房提供;CCK-8试剂盒(南京凯基生物公司);Annexin V-FITC/PI双染法凋亡检测试剂盒(上海贝博生物公司);Transwell装置、Matrigel(美国BD公司);cDNA合成试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒(大连宝生物公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 A549细胞在补充1%青霉素/链霉素混合液、10%胎牛血清的DMEM高糖培养基置于含5% CO2、37 ℃湿润培养箱孵育,细胞80%融合消化细胞,1∶4传代。

1.2.2 实验分组 取1 mL 2×104个对数期A549细胞接种24孔板,细胞50%时进行脂质体转染,即分别将si-NC、si-circ_0010235、pcDNA、pcDNA-circ_0010235转染到A549细胞中,在转染48 h时收集细胞,RT-qPCR检测circ_0010235水平以评估下调或上调circ_0010235表达效果。参照唐化勇等[5]实验方法制备天南星多糖:将洗净的天南星根茎粉碎,加入40×体积的蒸馏水,煮沸4 h;过滤后离心,将上清液浓缩至原体积的20%,加入无水乙醇,过夜后离心,在得到的沉淀中加入蒸馏水重复上述操作,二次沉淀得到的即为天南星多糖(纯度>91.5%)。实验时用细胞培养液稀释至实验浓度。分别用含0、50、100、200 μg/mL天南星多糖的培养液孵育A549细胞48 h,依次记为0、50、100、200 μg/mL天南星多糖组。转染si-NC、转染si-circ_0010235的A549细胞依次记为si-NC组、si-circ_0010235组;用含200 μg/mL天南星多糖孵育转染pcDNA、转染pcDNA-circ_0010235的A549细胞48 h,依次记为天南星多糖+pcDNA组、天南星多糖+pcDNA-circ_0010235组。

1.2.3 CCK-8和克隆形成实验检测细胞增殖 (1)CCK-8实验:取100 μL(5×103个/孔)未转染细胞、转染细胞接种96孔板,贴壁后根据实验分组给予对应剂量的天南星多糖孵育48 h。每孔加入10 μL CCK-8试剂于37 ℃培养箱孵育2 h。酶标仪测定450 nm各孔细胞光密度(OD)值。增殖抑制率=(1-OD实验组/OD对照组)×100%。(2)克隆形成实验:每组取8×102个细胞(40 μL)接种6孔,旋动平板使细胞均匀分散。置于37 ℃培养箱孵育两周后用4%多聚甲醛固定细胞集落,用0.1%结晶紫溶液染色并拍照。显微镜下进行细胞集落计数(>50个细胞)。

1.2.4 Transwell实验检测细胞迁移 将0、50、100、200 μg/mL天南星多糖组、si-NC组、si-circ_0010235组、天南星多糖+pcDNA组、天南星多糖+pcDNA-circ_0010235组细胞悬浮于不含血清的培养基中,细胞密度为1×106个/mL,取100 μL接种顶部腔室。在底部腔室中加入500 μL完全培养基。37 ℃培养箱孵育48 h后,用棉签擦去上室内的细胞,4%多聚甲醛固定,结晶紫染色,显微镜下观察染色细胞数,即为迁移细胞数。

1.2.5 流式细胞术检测细胞凋亡 将A549细胞接种到6孔板中,按照1.2.2的分组处理细胞,48 h后收集细胞,在结合缓冲液中重新悬浮,细胞密度为5×104个/mL。取5 μL Annexin V-FITC、10 μL PI试剂分别加入到500 μL细胞悬液中,避光孵育15 min。流式细胞仪检测凋亡细胞比例。右上(早凋)和右下(晚凋)象限的细胞百分率之和为凋亡率。

1.2.6 RT-qPCR检测circ_0010235表达 用TRIzol试剂从经过处理的0、50、100、200 μg/mL天南星多糖组、si-NC组、si-circ_0010235组、天南星多糖+pcDNA组、天南星多糖+pcDNA-circ_0010235组A549细胞分离总RNA,用cDNA合成试剂盒进行逆转录反应,用SYBR®Premix Ex TaqTM进行RT-qPCR。反应体系包括10 μL (2×)SYBR®Premix Ex TaqTM,2 μL PCR引物,0.4 μL ROX Reference Dye,1 μL 逆转录反应产物,补加ddH2O至20 μL。反应条件95 ℃ 5 min;95 ℃ 15 s,60 ℃ 30 s,72 ℃ 30 s,30个循环。circ_0010235上游引物5′-ACG TCT ACC CGG ATG ACA AG-3′,下游引物5′-CTG CGT GAA GGC TAA GAC G-3′;GAPDH上游引物5′-GGG AAG GTG AAG GTC G-3′,下游引物5′-GAA GAT GGT GAT GGG ATT-3′。GAPDH为内参,2-ΔΔCt法计算circ_0010235表达水平。circ_0010235相对表达水平=2-实验组(Ctcirc_0010235-CtGAPDH)-对照组(Ctcirc_0010235-CtGAPDH)。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 天南星多糖对A549细胞增殖、迁移的影响

与0 μg/mL组比较,50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL组天南星多糖处理后A549细胞抑制率升高(P<0.05),克隆形成数、迁移数均减少(P<0.05)。见表1。

表1 天南星多糖抑制A549细胞增殖和迁移

2.2 天南星多糖对A549细胞凋亡的影响

与0 μg/mL组比较,50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL组天南星多糖处理后A549细胞凋亡率升高(P<0.05)。见图2及表2。

表2 天南星多糖诱导A549细胞凋亡率

2.3 天南星多糖对A549细胞中circ_0010235表达的影响

与0 μg/mL组比较,50 μg/mL、100 μg/mL、200 μg/mL组天南星多糖处理后A549细胞circ_0010235表达水平降低(P<0.05)。见表3。

表3 天南星多糖对A549细胞中circ_0010235表达的检测

2.4 下调circ_0010235对A549细胞增殖、凋亡和迁移的影响

与si-NC组比较,si-circ_0010235组A549细胞抑制率、凋亡率均升高(P<0.05),circ_0010235表达水平、克隆形成数、迁移数均减少(P<0.05)。见图3及表4。

表4 下调circ_0010235对A549细胞增殖迁移及凋亡的影响

2.5 上调circ_0010235表达部分逆转天南星多对A549细胞增殖、凋亡、迁移的影响

与天南星多糖+pcDNA组比较,天南星多糖+ pcDNA-circ_0010235组A549细胞circ_0010235表达水平、克隆形成数、迁移数均增加(P<0.05),抑制率、凋亡率均降低(P<0.05)。见图4及表5。

表5 circ_0010235可逆转天南星多糖对A549细胞增殖凋亡迁移的作用

3 讨论

中药化合物可诱导肿瘤凋亡,阻滞细胞周期,抑制肿瘤转移,影响免疫反应,是肿瘤治疗潜在候选药物[14-16]。研究[4]报道天南星多糖可抑制S180荷瘤小鼠肿瘤形成,促进抗肿瘤免疫因子合成,从而增强机制的抗肿瘤免疫能力。天南星多糖通过抑制Wnt/β-连环蛋白(β-catenin)通路对肾癌细胞增殖具有一定抑制作用,并可诱导细胞G0/G1期阻滞和凋亡[5]。天南星多糖还通过抑制磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号通路激活来抑制乳腺癌细胞增殖和上皮间质转化,诱导细胞凋亡,其与顺铂合用可提供协同作用,这些证据提示天南星多糖在癌症治疗中的重要性[6]。本研究结果显示,天南星多糖以剂量依赖方式降低A549细胞增殖能力,减少克隆形成和迁移数量,增加细胞凋亡率,提示天南星多糖可通过抑制肺癌细胞增殖和转移从而抑制肺癌进展。

circRNA是非编码RNA的重要组分,具有吸附miRNA功能,circRNA异常表达在肺癌的癌变和发展中发挥重要调控作用[17]。此外,circRNA还可能是中药化合物抗肺癌的潜在靶点,Yu等[18]研究发现染料木素通过调控circ_0031250/miR-873-5p/叉头框转录因子M1(FOXM1)轴来抑制非小细胞肺癌的进展。肉桂醛对肺癌细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用与上调circ_0043256表达有关[19]。既往研究[20]显示,circ_0010235在肺癌组织和细胞中过表达,其缺失可通过不同途径限制肺癌细胞系的增殖和转移,并促进肺癌细胞凋亡。故本研究推测天南星多糖可能通过调控circ_0010235表达发挥抗肺癌作用。本研究结果显示,天南星多糖以剂量依赖方式下调A549细胞中circ_0010235表达水平,提示circ_0010235低表达可能介导天南星多糖的抗肺癌作用。下调circ_0010235表达可抑制降低A549细胞增殖能力,减少克隆形成和迁移数量,增加细胞凋亡率,与Zhu等[21]报道下调circ_0010235表达在肺癌中的抑癌作用一致。为证实天南星多糖的抗肺癌作用依赖于circ_0010235表达下调,本研究将pcDNA-circ_0010235转染至A549细胞,结果显示上调circ_0010235表达减弱天南星多糖对A549细胞的抗增殖、促凋亡和抗迁移作用,进一步证实天南星多糖可能通过下调circ_0010235表达来抑制肺癌进展。

综上,天南星多糖通过抑制细胞增殖、迁移及诱导细胞凋亡来发挥抗肺癌活性,其机制可能与下调circ_0010235表达有关,这为天南星多糖的抗肿瘤活性提供新的见解,为开发天南星多糖防治肺癌提供重要依据。