超高效液相色谱串联质谱法同时测定养阴清肺合剂中3种成分含量*

2023-07-14李应才黄合琤马文思

中国药业 2023年13期

李应才，黄合琤，马文思，杨野

（1. 云南省昆明市食品药品检验所，云南昆明 650032； 2. 昆明理工大学，云南昆明 650500）

养阴清肺合剂由地黄、麦冬、玄参、川贝母、牡丹皮等8味中药组方，具有养阴润燥、清肺利咽等功效，用于治疗阴虚肺燥、咽喉干痛、干咳少痰或痰中带血［1］。地黄的主要化学成分包括梓醇、地黄苷D 和地黄苷A，具有降血糖和调节免疫活性作用［2-4］。玄参中主要含有哈巴苷和哈巴俄苷环烯醚萜苷类化合物，具有降血压、镇痛、解痉、抗乙肝病毒、增强免疫等作用［5-9］。但现行标准中仅载有薄层鉴别，未对各有效成分进行含量测定［1］，尚不能全面反映药品质量。已有研究采用高效液相色谱法单独测定各药材中的相关成分［10-17］。《中药新药质量标准研究技术指导原则（试行）》中明确提出，复方制剂鼓励建立多个含量测定指标，并规定含量范围［18］。超高效液相色谱串联质谱（UPLC - MS/ MS）法同时具备超快速液相色谱分离和高灵敏度质谱检测功能，能实现目标物快速、准确定性定量研究［19-23］。本研究中建立了同时测定养阴清肺合剂中地黄苷D、哈巴苷、哈巴俄苷3 种活性成分含量的UPLC - MS/MS 法，为其质量标准的提升提供参考。现报道如下。

1 仪器与试药

1.1 仪器

5500+QTRAP型质谱仪（AB SCIEX 公司）；LC-40型超快速液相色谱仪（日本岛津公司）；AL104型电子分析天平（梅特勒-托利多仪器＜上海＞有限公司，精度为万分之一）；Arium comfortⅡ型超纯水仪（Sartorius 公司）；SONOREXRK 255 型超声波清洗器（德国Bandelin公司，功率为250 W，频率为33 kHz）。

1.2 试药

地黄苷D 对照品（批号112063 - 202103，纯度94.2%），哈巴苷对照品（批号111729 - 201707，纯度96.8%），哈巴俄苷对照品（批号111730-202110，纯度96.8%），均购自中国食品药品检定研究院；甲醇（Thermo Fisher 公司，色谱纯）；养阴清肺合剂（广州白云山潘高寿药业股份有限公司，批号分别为2203008，2111029A，2203003）。

2 方法与结果

2.1 试验条件

2.1.1 色谱条件

色谱柱：Agilent Poroshell 120 EC C18柱（50 mm ×2.1 mm，1.7 μm）；流动相：含0.1%甲酸溶液的5 mmoL/L乙酸铵（A）- 甲醇（B），梯度洗脱（0～1.00 min 时95%A，2.00～5.00 min 时5%A，5.10～6.00 min 时95%A）；流速：0.2 mL/min；柱温：35 ℃；进样量：5 μL。

2.1.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源；离子源温度：550 ℃；监测模式：正负离子模式；离子源电压：4.5 kV；喷雾气（Gas1）：50 Psi；辅助加热气（Gas2）：50 Psi；气帘气：20 Psi；监测模式：多反应监测（MRM）。地黄苷D、哈巴苷、哈巴俄苷的质谱参数见表1。

表1 各成分质谱参数Tab.1 MS parameters for each component

2.2 溶液制备

对照品溶液：取地黄苷D、哈巴苷、哈巴俄苷对照品各适量，精密称定，分别置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，摇匀，即得地黄苷D、哈巴苷、哈巴俄苷质量浓度分别为117.75，120.03，106.45 μg/ mL 的对照品溶液。分别精密量取上述对照品溶液各适量，置同一10 mL容量瓶中，加40%甲醇定容，摇匀，即得黄苷D、哈巴苷、哈巴俄苷质量浓度分别为1.177 5，1.200 3，1.064 5 μg/mL的混合对照品溶液。

供试品溶液：取样品0.20 mL，置50 mL容量瓶中，加40%甲醇适量，超声处理（功率为250 W，频率为33 kHz）30 min，放冷，加40% 甲醇定容，摇匀，0.22 μm 滤膜滤过，取续滤液，即得。

阴性对照品溶液：按处方［1］，取除地黄外的其他7 味药材作为阴性样品1，取除玄参外的其他7 味药材作为阴性样品2，分别加水煎煮2 h，放冷，滤过，加水定容至500 mL，即得。

2.3 方法学考察

专属性试验：取2.2 项下对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液，按2.1 项下试验条件分别进样测定，采用MRM 模式对目标离子进行监测，能有效排除基质干扰。供试品溶液和对照品溶液色谱中，各成分峰保留时间一致，峰形良好，且杂质及阴性样品对检测无干扰。色谱图见图1。

a. 地黄苷D b. 哈巴苷 c. 哈巴俄苷A1，A2. 阴性对照品溶液（分别缺地黄、玄参） B. 对照品溶液 C. 供试品溶液图1 MRM色谱图a.Rehmanin D b.Harpagoside c.HarpagosA1，A2.Negative reference solution（lacking Rehmanniae Radix and Scrophulariae Radix，respectively） B.Reference solution C.Test solutionFig.1 MRM chromatograms

线性关系考察：精密吸取2.2项下混合对照品溶液适量，用40% 甲醇逐级稀释成系列质量浓度的对照品混合溶液，按2.1 项下试验条件测定，以各成分质量浓度（X，ng/mL）为横坐标、定量离子对峰面积（Y）为纵坐标进行线性回归。结果见表2。

表2 各成分线性关系考察结果（n=6）Tab.2 Results of the linear relation test of each component（n=6）

定量限与检测限确定：精密吸取2.2项下混合对照品溶液，用40%甲醇逐级稀释，按2.1 项下试验条件测定。分别以信噪比（S/N）为10 和3 时的质量浓度为定量限和检测限。结果地黄苷D、哈巴苷、哈巴俄苷的定量限分别为2.32，1.00，0.06 ng/ mL，检测限分别为0.70，0.30，0.02 ng/mL。

精密度试验：取线性关系考察项下地黄苷D、哈巴苷、哈巴俄苷质量浓度分别为235.45，240.61，212.92 ng/mL的混合对照品溶液，按2.1项下试验条件连续进样测定6 次。结果地黄苷D、哈巴苷、哈巴俄苷峰面积的RSD分别为0.61%，1.01%，1.22%（n= 6），表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取样品（批号为2203008），依法制备供试品溶液，在室温下分别于0，2，4，6，8，12，24 h时按2.1项下试验条件进样测定。结果地黄苷D、哈巴苷、哈巴俄苷峰面积的RSD分别为1.86%，0.47%，2.15%（n=7），表明供试品溶液在室温下放置24 h稳定性良好。

重复性试验：取样品（批号为2203008）6 份，每份0.20 mL，按2.2 项下方法制备供试品溶液，按2.1 项下试验条件进样测定，计算待测成分的含量。结果地黄苷D、哈巴苷、哈巴俄苷含量的RSD分别为1.30%，0.62%，0.97%（n=6），表明方法重复性良好。

加样回收试验：取样品（批号为2203008）9份，每份0.20 mL，精密加入低、中、高质量浓度的混合对照品溶液，依法制备供试品溶液，按2.1 项下试验条件进样测定，计算加样回收率。结果见表3。

表3 加样回收试验结果（n=9）Tab.3 Results of the recovery test（n=9）

2.4 样品含量测定

取3 批样品（批号分别为2203008，2111029A，2203003），按2.2项下方法制备供试品溶液，取样0.20 mL，按2.1 项下试验条件进样测定2 次，代入回归方程计算待测成分的含量。结果见表4。

表4 各成分含量测定结果（μg/mL，n=2）Tab.4 Results of the content determination of each component in samples（μg/mL，n=2）

3 讨论

3.1 流动相优化

本研究中采用正负离子模式扫描，故优化了流动相，选择含0.1%甲酸溶液的5 mmoL/L 乙酸铵作为水相，甲醇作为有机相，梯度洗脱分离，分离效果良好。

3.2 质谱条件优化

负离子模式下，哈巴苷主要形成m/z363.2［M-H］-准分子离子，哈巴俄苷主要形成m/z493.3［M - H］-准分子离子；正离子模式下，哈巴苷主要形成m/z387.2［M + Na］+准分子离子，哈巴俄苷主要形成m/z517.2［M + Na］+准分子离子。哈巴苷负离子模式下的响应值更高，哈巴俄苷正离子模式下的响应值更高，地黄苷D 正离子模式下能形成稳定的离子。综合考虑，选择正负离子扫描模式。

3.3 提取溶剂、超声提取时间选择

比较不同体积分数甲醇（10%，20%，30%，40%，50%，60%，80%，100%）对提取效果的影响，甲醇为提取溶剂时，地黄苷D 出现双峰，考虑为纯甲醇造成的溶剂效应；甲醇体积分数低于30%时，哈巴俄苷易形成肩峰；甲醇体积分数为40%时，各化合物峰形较好，响应较高。故选择40%甲醇作为提取溶剂。比较不同超声提取时间（15，20，30，40，60 min）对提取效果的影响，超声处理20 min 时，待测成分不能提取完全；超声30，40，60 min时，待测成分的含量差异较小。故选择超声提取时间为30 min。