不同抽提方式在流行性感冒病毒检测中的抽提效率研究*

张相猛,周志豪,潘俊锋,徐秋芳

上海市青浦区疾病预防控制中心微生物检验科,上海 201700

流行性感冒(流感)病毒以呼吸道为入侵门户,在呼吸道黏膜上皮细胞中增殖,引起呼吸道局部感染或导致呼吸道以外组织器官病变。作为最常见的呼吸道病毒,流感病毒的肆虐每年造成巨大的经济损失。目前,至少还有200多种病毒可以引起呼吸道感染,如呼吸道合胞病毒、冠状病毒等[1-2]。新型冠状病毒感染疫情是由新型冠状病毒引起的全球应急事件。流感病毒实验室常规检测方法为实时荧光定量聚合酶链反应(PCR),其具有灵敏度高,特异性强的优势[3]。但是在实验室检测过程中多种因素可导致假阴性结果,尤其是在对弱阳性标本进行检测时更为明显。

其中核酸抽提是病毒核酸检测的重要环节,核酸抽提结果直接影响核酸检测的灵敏度和特异度[4]。传统的核酸抽提方法为沉淀离心手工抽提法,手工抽提对实验人员操作要求较高,且耗时较长。随着磁珠分离技术在生物科学领域不断普及和广泛应用,该技术逐步用于核酸自动抽提,不仅大大提高了核酸抽提的效率,还减少了人工操作的误差[5-6]。其原理为特殊包被的磁珠对样品中的核酸具有很强的吸附力,从而达到抽提、纯化标本中核酸的效果[7-8]。为了进一步提高检测效率,一些生物公司研制的全自动核酸抽提仪推出了快速抽提和普通抽提两种模式。二者的主要差异在于组分和结合时间不同[9],快速抽提法所需时间较普通抽提法短,但是抽提时间及程序的不同会影响到核酸检测的质量,出现漏检情况,从而影响对疫情的早期研判、导致疫情扩散。

1 材料与方法

1.1菌株来源 选取本中心核酸检测阳性流感患者临床标本分离到的乙型流感病毒Victoria型毒株作为研究对象。

1.2仪器与试剂 全自动核酸抽提仪(江苏硕世科技股份有限公司)、Light Cycle 480Ⅱ实时荧光定量PCR仪(瑞士罗氏公司)。乙型流感病毒Victoria型核酸检测试剂盒(荧光PCR法,上海之江生物科技股份有限公司,批号:20220403),核酸快速抽提试剂盒(磁珠法,硕世生物科技股份有限公司,批号:202205174),核酸普通抽提试剂盒(磁珠法,硕世生物科技股份有限公司,批号:20220276)。

1.3方法

1.3.1菌株处理 将流感病毒毒株高速离心去除杂质后留取上清液,将上清液按照1∶10、1∶100倍比稀释至1∶109。

1.3.2核酸抽提 采用同一台核酸抽提仪按以下步骤对标本进行核酸抽提。快速抽提法参数设定为90 ℃裂解0 s,磁珠重悬10 s,结合400 s,洗涤30 s,90 ℃洗脱120 s,弃磁珠。普通抽提法参数设定为90 ℃裂解5 min,磁珠重悬1 min,结合10 min,洗涤8 min,90 ℃洗脱3 min,弃磁珠。

1.3.3核酸检测 采用全自动核酸检测仪对抽提后的核酸进行核酸检测,按照乙型流感病毒Victoria型核酸检测试剂盒要求配制好核酸检测体系。加样后置于Light Cycle 480Ⅱ实时荧光定量PCR仪,参数设定为45 ℃、10 min,95 ℃、15 min,95 ℃、15 s,60 ℃、60 s,循环次数设定为40次。在60 ℃时进行荧光检测,检测通道为FAM通道。

1.3.4结果判定 靶标检测结果判定标准:扩增曲线不呈S型,Ct值>39或Ct值空白为阴性;扩增曲线呈S型,且Ct值≤39为阳性。

1.4观察指标

1.4.1检出率 采用两种抽提方法将各稀释倍数标本平行检测4次,实时荧光定量PCR检测后Ct值≤39为检出病毒基因,比较各稀释倍数下不同抽提方法平行检测的检出率。

1.4.3线性 以稀释倍数的对数为横坐标,各稀释倍数平行检测4次Ct值均值为纵坐标,比较两种方法稀释倍数与Ct值的线性关系。

2 结 果

2.1两种抽提方法检测结果 采用两种方法对各稀释倍数标本进行平行核酸抽提后,经实时荧光定量PCR检测,结果显示快速抽提法在原液至106稀释倍数均能检出,稀释至107倍后4次平行检测检出率为50%,稀释至108倍后不再检出。普通抽提法在原液至107稀释倍数均能检出,稀释至108倍后4次平行检测检出率为75%,稀释至109倍后不再检出。两种方法在不同稀释倍数的检出率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。见表1。

表1 两种抽提方法不同稀释倍数检测的Ct值

2.2两种抽提方法重复性比较 对标本平行检测4次,核酸抽提后各稀释倍数实时荧光定量PCR检测结果CV值见表2。结果显示,不同稀释倍数下普通抽提法CV值均低于快速抽提法。两种方法在原液至107稀释倍数的CV值差异有统计学意义(P<0.05)。

表2 两种抽提方法不同稀释倍数的重复性

2.3两种抽提方法线性比较 采用两种方法对各稀释倍数标本进行核酸抽提后,实时荧光定量PCR检测结果显示,不同稀释倍数下普通提取法Ct值均小于快速提取法,原液至105稀释倍数下两种方法Ct值结果差异无统计学意义(P>0.05),106～107稀释倍数下两种方法Ct值结果差异有统计学意义(P<0.05)。各稀释倍数线性关系良好,快速抽提法回归方程为Y=2.86X+14.42,R2=0.971。普通抽提法回归方程为Y=2.805X+13.61,R2=0.983。见图1。

图1 不同抽提方法的线性关系

3 讨 论

自新型冠状病毒感染疫情暴发以来,在疫情早期处置中,尤其是高致病性呼吸道传染病疫情处置中要求实验结果的出具快速、准确。因此一些生物公司推出的快速抽提法核酸抽提试剂盒在普通抽提法的基础上简化了流程。快速抽提法较普通抽提法能较大限度减少样品核酸抽提时间,在疫情处置中发挥重大作用。但是实时荧光定量PCR检测病毒核酸的灵敏度受多种因素的影响,如核酸模板的质量、引物与探针的特异性[10],这些影响因素中核酸模板的质量极其重要,核酸提取的质量不佳可能会导致病毒载量低的标本出现假阴性结果。核酸抽提条件的改变能影响标本核酸抽提效率[11-13],从而影响实时荧光定量PCR的检测结果。

病毒的核酸抽提方法目前主要为磁珠法,其操作步骤大致分为裂解、结合和洗脱。与普通抽提法比较,快速抽提法缩短了这3个步骤时间。裂解过程能裂解病毒表面蛋白质,有助于标本充分释放核酸[14]。结合过程能让磁珠充分吸附核酸。洗涤液主要用来去除抽提过程中产生的蛋白类抑制物,该物质被带入核酸检测的产品中容易导致低浓度的标本检测不出[15]。本研究结果显示,去掉或者缩短某些步骤对核酸抽提效率有一定影响。

本研究选取流感病毒进行实验,结果显示在检出率方面,低稀释倍数(稀释倍数≤106)标本中两种方法均能检出病毒核酸,高稀释倍数(稀释倍数≥107)标本或当Ct值接近临界值时,快速抽提法检出率较普通抽提法有所下降,且随着稀释倍数的增加,两者之间Ct值差异越大。这提示快速抽提法在病毒含量低的标本中检出率低于普通抽提法,因此可能会导致阳性标本漏检。CV值是考查检测方法重复性的指标[16],本研究中普通抽提法CV值在各个稀释倍数均明显低于快速抽提法,显示在稳定性方面普通抽提法明显优于快速抽提法。不同稀释倍数普通抽提法Ct值均小于快速抽提法,且不同稀释倍数下线性优于快速抽提法,提示普通抽提法抽提效率高于快速抽提法。

病毒性传染病的筛查工作以“早发现、早诊断、早隔离、早治疗”为重点。快速抽提法具有检测时间短、成本低的优点,能有效节省时间和成本,满足疫情早期大批量标本检测的要求。但是在抽提多类型复杂标本或病毒含量较低的标本时,快速抽提法可能导致结果出现假阴性,建议采用抽提纯化和抽提效率更有保证的普通抽提法,确保检测结果的准确性,以避免漏检,从而导致疫情扩散。

本研究仍存在一定的局限性,由于倍比稀释对标本浓度要求较高,本研究采用的研究对象是经临床标本分离培养得到的流感病毒毒株,而日常检测中血液、鼻咽拭子等标本形式多样且存在各种杂质,标本具有一定的复杂性,均一性也更差[17]。采用临床标本开展实验更贴近实际,也更能对比两种抽提方法对复杂类型标本的抽提效果。