浓缩沼液中添加芽孢杆菌对促生和抑菌功能的强化效应

刘艳丽 赵娜娜 范贝贝,2 李乃荟 董泰丽 陈 清 慕康国*

(1.中国农业大学 资源与环境学院,北京 100193;2.中国农业大学 有机循环研究院(苏州),江苏 苏州 215000;3.东北农业大学 园艺园林学院,哈尔滨 150038;4.山东民和生物科技股份有限公司,山东 烟台 264000)

随着畜禽养殖业和沼气工程的发展,沼液的排放量与日俱增,其利用途径也成为环保及农业领域新的关注热点。沼液含有大量的氮磷钾等营养元素,以及氨基酸、腐植酸、维生素和生长激素等活性物质,可以作为良好的液体有机肥料,同时也具有抑病功能[1]。大量研究表明,长期施用沼液可以有效改善土壤肥力,促进农作物生长,增加作物产量[2-4]。对种子而言,外源施用沼液能提高种子养分转运、酶活性以及新陈代谢能力,从而促进种子的萌发和提高种子的成秧率[5]。此外,沼液中的活性物质对一些病原菌具有抑制性作用,可以增强植物对于抵抗多种病原菌侵袭的能力,减少农药施用,提高资源利用效率[6-7]。但沼液水分含量高,直接施用肥效不高,而且运输成本高,商品化利用较困难,严重制约了沼液肥的推广与应用[8]。利用膜浓缩技术对沼液进行浓缩,可以提高沼液的营养物质含量,有助于提高沼液的肥料价值。然而采用膜浓缩技术成本较高,仍需要复配其他活性物质增强沼液的功能,从而实现沼液肥的市场化推广[9-11]。

土传病害每年都会给农业生产造成重大经济损失,常见的毁灭性土传病害主要有枯萎病、软腐病、纹枯病和青枯病等。生物防治因其低成本、环境友好和无药物残留等特点已成为当前国内外防治植物土传病害的研究热点[12]。芽孢杆菌广泛分布于自然界中,具有抗逆性强、耐高温及生防效果好等优点,已成为理想的土传病害生防菌资源[13]。同时,芽孢杆菌及其代谢产物可以有效提高土壤肥力、改善土壤环境、提升作物品质以及增强植株抗病能力[14]。大量研究表明,芽孢杆菌通过定殖至植物根际、体表或体内,与病原菌竞争植物周围的营养,分泌抗菌物质以抑制病原菌生长,同时诱导植物防御系统抵御病原菌入侵,从而达到生防的目的[15]。

具有多种功能的复合肥料已成为国内外新型肥料的主要研究内容之一。芽孢杆菌等微生物与沼液复配,兼具了有机肥和微生物肥料的优点,不仅含有大量有机质和营养养分,还含有大量生防微生物及其代谢产物,可以有效提高土壤肥力,恢复土壤微生态平衡,提升作物品质,增强植株抗病能力[16]。孙天姿等[17]将巨大芽孢杆菌添加到餐厨沼液中所制备的液态菌肥显著提高了冬小麦和水稻土壤中有效氮磷的含量。也有研究表明,施用沼液微生物菌肥可显著提高设施蔬菜的生物量和品质[18]。芽孢杆菌与沼液联用不仅避免了沼液排放带来的环境问题,还实现了沼液的增值化利用,具有较高的环保效益、经济效益和社会效益。

沼液肥中芽孢杆菌的活菌数是发挥肥效至关重要的一点,通常沼液的EC较高且pH为碱性,对芽孢杆菌的活性有一定影响[19]。因此,针对现有问题,本研究通过在浓缩沼液中添加甘油等保护剂来探究芽孢杆菌在浓缩沼液中的存活情况以及两者复配后的促生抑病效果。本研究在前期试验中采用Salkowski比色法测定了8种芽孢杆菌生产生长素(IAA)的能力,其类别分别为解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、侧孢芽孢杆菌(B.laterosporus)、巨大芽孢杆菌(B.megatherium)和枯草芽孢杆菌(B.subtilis),最终选择IAA产量较高的解淀粉芽孢杆菌B3和浓缩沼液进行复配。促生功能的探究需要大量的发芽试验、盆栽试验以及田间试验来验证。种子发芽是植物生长中最基础和最重要的一步,可以有效体现作物的出苗质量,而且种子整个发芽周期很短,方便大批量进行。小麦、黄瓜和白菜在我国种植范围广泛,是我国重要的粮食作物和蔬菜作物[20]。皿内抑菌试验可以快速验证肥料对于不同土传病原菌的抑菌效果。本研究采用芽孢杆菌与沼液复配制备沼液菌肥,通过研究配制的芽孢杆菌沼液肥对小麦、白菜和黄瓜种子发芽的增强效果,同时探究芽孢杆菌沼液肥对尖孢镰刀菌黄瓜专化型(F.oxysporumf.sp.Cucumerinum)、尖孢镰刀菌番茄专化型(F.oxysporumf.sp.lycopersici)和茄镰孢菌(Fusariumsolani)的抑菌效果,验证所配制的芽孢杆菌沼液肥的促生和抑菌效果,为沼液增值化利用和农业生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

供试芽孢杆菌:解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)为水溶性工程菌粉,活菌数≥1011CFU/g。供试厂家为湖北中向生物工程有限公司。

供试浓缩沼液:鸡粪浓缩沼液。将鸡粪沼液进行预处理以去除其中的大量悬浮物,然后采用孔径为1～100 nm的无机陶瓷超滤膜进行过滤,去除沼液中多余的水分和杂质,得到浓缩鸡粪沼液。沼液外观颜色为棕褐色或棕黑色液,pH为9.20,EC值为32.00 mS/cm,有机质质量浓度为4.5 g/L,腐植酸质量浓度1.9 g/L,总氮质量浓度5 g/L,总磷质量浓度2.4 g/L,总钾质量浓度5.6 g/L,钙质量浓度为864 mg/L,铁质量浓度为104 mg/L,镁质量浓度为25 mg/L,锰质量浓度为16 mg/L,锌质量浓度为16 mg/L,铜质量浓度为11 mg/L。

供试种子:小麦种子(品种为‘轮选987’)、白菜种子(品种为‘绿如意’)和黄瓜种子(品种为‘津研4号’)购买于中国农业科学院。

供试病原菌:尖孢镰刀菌黄瓜专化型、尖孢镰刀菌番茄专化型和茄镰孢菌,由中国农业科学院提供,在PDA培养基活化后备用。

供试培养基:LB(营养肉汤)培养基,配料为每升LB培养基含有NaCl 10.0 g、胰蛋白胨10.0 g、酵母粉5.0 g、琼脂20.0 g,pH为7.0～7.2,121 ℃高压灭菌30 min后备用。

1.2 含芽孢杆菌沼液肥的配制及存放过程中活菌数的测定

将复配的增效物质以及甘油等作为保护剂添加到浓缩沼液中,在温度为60 ℃、转速为60 r/min磁力搅拌器上加热搅拌60 min,然后按照50 g/L加入解淀粉芽孢杆菌。混合均匀后分别将其分装在灭菌后的离心管中,25 ℃室温条件下避光保存。分别在存放第0、7、30、45和90天取样测定活菌数,每次取3管,采用稀释涂布平板法测定活菌数。将浓缩沼液与芽孢杆菌的混合液按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7浓度梯度进行稀释。用无菌枪头吸取100 μL液体涂布于LB培养基平板中,不同梯度各涂3个平板,涂布均匀,将平板放入26 ℃培养箱中恒温培养2～3 d后,计数。计数时应选择菌落数在30～300 CFU/g的平板进行计数。

1.3 试验设计

试验以无菌水作为空白对照,BS为原浓缩沼液,BSF为沼液肥(添加甘油等保护剂的浓缩沼液),B3为芽孢杆菌菌液(每50 g解淀粉芽孢杆菌菌粉配制1 L菌液),FA为配制的芽孢杆菌沼液肥,FB为存放30 d的芽孢杆菌沼液肥。具体试验设计见表1。

表1 不同试验处理的稀释倍数Table 1 Dilution ratio of different test treatments

1.4 含芽孢杆菌沼液肥的皿内发芽试验

试验于2021年2～3月在中国农业大学西校区进行。挑选籽粒饱满且大小基本一致的种子,在1%的NaClO溶液中浸泡消毒10 min,期间不断搅拌;用去离子水冲洗3次后,风干至初始含水量。在直径为9 cm的培养皿中放入一层无菌定性滤纸,分别加入不同稀释倍数的10 mL处理液,然后均匀放置20粒种子,加皿盖保湿,置于温度为25 ℃培养箱中暗培养,每个处理9次重复。测定根长、芽长、发芽率、发芽指数、发芽势和活力指数[21]。根长和芽长用精度为1 mm米尺直接测量。

根据农作物种子检验规程,以胚根长超过种子长度的1/2计为发芽,每天记录种子的萌发数。试验结束标准为:连续2 d发芽数不发生变化。

发芽势(率)=供试种子的发芽数/供试种子数×100%

(1)

式中:发芽势在第2天统计,%;发芽率在第5天统计,%。

发芽指数(GI)=ΣGt/Dt

(2)

式中:Gt为第t日的种子萌发数,粒;Dt为相应的种子萌发天数,d。

活力指数(VI)= GI×S

(3)

式中:GI为发芽指数;S为平均根长,mm。

1.5 含芽孢杆菌沼液肥的平板抑菌试验

吸取100 μL稀释不同倍数的处理液,均匀涂布到PDA培养基表面,每个处理9次重复。然后用打孔器从培养好的病原菌菌株中取直径为5 mm的菌饼,倒扣于平板的中央,每个培养皿中放1个菌饼,将接种病原菌的平板放于28 ℃培养箱中黑暗培养3～10 d(视菌落生长情况而定)。用十字交叉法测量菌落直径,并计算菌丝生长的抑菌率(Antifungal index,AI)[22]。公式如下:

(4)

1.6 数据处理

采用Microsoft Excel软件进行数据处理,采用Origin 2021软件作图,采用SPSS 21.0软件进行单因素方差分析。

2 结果与分析

2.1 含芽孢杆菌沼液肥存放过程中活菌数的变化

通过稀释涂布平板法测定芽孢杆菌沼液肥随存放时间活菌数的变化(图1),沼液肥中芽孢杆菌的数量随存放时间的增加而减少。其中,存放时间为0～30 d减少趋势最明显,在第30天时,芽孢杆菌沼液肥中活菌数为3×109CFU/mL,存活率为48.4%;存放时间为30～90 d时活菌数基本保持稳定,无显著差异。存放90 d时芽孢杆菌活菌数的数量为2.8×109CFU/mL,满足中华人民共和国农业部NY/T 798—2015《复合微生物肥料执行标准》[22]中对于复合微生物肥料中活菌数量的规定(5×107CFU/mL)。

图中不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。Small letters in the figure indicate significant differences (P<0.05).

2.2 芽孢杆菌沼液肥对种子发芽的影响

2.2.1对黄瓜种子发芽的影响

通过发芽试验测定了芽孢杆菌沼液肥等物质对黄瓜种子发芽的影响,如图2(a)～(e)所示。与对照相比,稀释250和500倍的含芽孢杆菌沼液肥处理(FA和FB)降低了黄瓜种子的发芽势和发芽指数,对黄瓜种子的萌发具有抑制作用。但稀释1 000倍的含芽孢杆菌沼液肥处理提高了黄瓜种子的发芽势和发芽指数。其中,稀释1 000倍的FA和FB处理的黄瓜种子发芽势分别为87.8%和87.2%,比对照分别提高15.3%和14.6%。稀释1 000倍的FB显著促进了黄瓜种子的发芽率(图2(b))。

图中小写字母表示同一浓度的不同处理之间差异显著(P<0.05)。图中序号代表的具体处理详见表2。下同。Small letters in the figure indicate significant differences among different treatments at the same concentration (P<0.05).See Table 2 for specific treatments represented by serial numbers in the figure.The same below.

所有处理均不同程度增加了黄瓜种子的芽长、根长和活力指数(图2(c)、(d)和(f)),稀释1 000倍的含芽孢杆菌沼液肥对黄瓜种子的芽长和根长的促进作用显著高于稀释1 000倍的沼液肥和芽孢杆菌菌液处理。与对照相比,稀释1 000倍的FA和FB能显著增加黄瓜种子的芽长和根长,芽长分别为48.9和47.0 mm,分别增加了56.3%和50.1%;根长分别为52.7和53.0 mm,分别增加了72.3%和73.3%。与BSF的1 000倍稀释液处理相比,FA和FB的1 000倍稀释液处理使根长分别增加了2.1%和12.8%,与芽孢杆菌菌液的1 000倍稀释液相比,根长分别增加了18.8%和18.2%。

2.2.2对小麦种子发芽的影响

芽孢杆菌沼液肥等物质对于小麦种子发芽的影响如图3所示。芽孢杆菌沼液肥(FA和FB)的250和500倍稀释液处理的小麦种子发芽势和发芽指数显著低于其他处理,但FA和FB的1 000倍稀释液处理显著提高了小麦种子的发芽势和发芽指数。FA和FB的1 000倍稀释液的发芽势分别为87.2%和86.4%,与对照相比,分别提高22.7%和21.6%(图3(a)和(e))。FA和FB处理对小麦种子的发芽率没有显著影响(图3(b))。所有处理对小麦种子的芽长、根长和活力指数均有不同程度的促进作用。芽孢杆菌沼液肥(FA和FB)对小麦种子的根部促进作用较明显,1 000倍稀释液处理的小麦种子根长分别可达118.9和117.1 mm,与对照相比,分别提高47.5%和45.2%;与沼液肥的1 000倍稀释液相比,根长分别提高了7.1%和5.4%;与芽孢杆菌菌液的1 000倍稀释液相比,分别提高了27.3%和25.3%(图3(c)、(d)和(f))。

图3 不同处理肥料对小麦种子发芽势(a)、发芽率(b)、芽长(c)、根长(d)、发芽指数(e)和活力指数(f)的影响Fig.3 Effects of different fertilizer treatments on germination potential (a),germination rate (b),bud length (c),root length (d),germination index (e) and vigor index (f) of wheat seeds

2.2.3对白菜种子发芽的影响

芽孢杆菌沼液肥等物质对白菜种子发芽的影响见图4。芽孢杆菌沼液肥(FA和FB)的250和500倍稀释液处理显著降低了白菜种子的发芽势和发芽指数。但FA和FB的1 000倍稀释液处理提高了白菜种子的发芽势和发芽指数,与对照相比,分别提高14.3%和13.7%(图4(a)和(e))。所有处理均显著提高了白菜种子的活力指数(图4(f))。FA和FB的1 000倍稀释液处理的白菜种子的根长分别可达78.3和78.9 mm,与对照相比,分别提高50.6%和51.7%。此外,与沼液肥1 000倍稀释液相比,FA和FB的1 000倍稀释液处理使根长分别提高了6.2%和7.1%;与芽孢杆菌菌液的1 000倍稀释液相比,根长分别提高了50.6%和51.7%(图4(b)和(c))。

图4 不同处理肥料对白菜种子发芽势(a)、发芽率(b)、芽长(c)、根长(d)、发芽指数(e)和活力指数(f)的影响Fig.4 Effects of different fertilizer treatments on germination potential (a),germination rate (b),bud length (c),root length (d),germination index (e) and vitality index (f) of Chinese cabbage seeds

2.3 含芽孢杆菌沼液肥的平板抑菌效果

在本研究中,随着稀释倍数的增加,所有处理的病原菌的菌落直径增加(图5和6)。与无菌水处理相比,稀释1 000、5 000和10 000倍的原浓缩沼液、沼液肥、芽孢杆菌溶液、含芽孢杆菌沼液肥(现配现用)和含芽孢杆菌沼液肥(存放30 d)对尖孢镰刀菌黄瓜专化型、尖孢镰刀菌番茄专化型和茄镰孢菌均表现出显著的抑制效果。与沼液肥相比,含芽孢杆菌的沼液肥对病原菌具有显著的抑制作用。原浓缩沼液的1 000倍稀释液对尖孢镰刀菌黄瓜专化型、尖孢镰刀菌番茄专化型和茄镰孢菌的抑菌率分别为62.1%、63.5%和62.1%,10 000倍稀释液对尖孢镰刀菌黄瓜专化型、尖孢镰刀菌番茄专化型和茄镰孢菌困的抑菌率分别为47.7%、47.7%和49.2%。芽孢杆菌菌液(B3)和芽孢杆菌沼液肥(FA和FB)的1 000倍稀释液对尖孢镰刀菌黄瓜专化型的抑菌率分别为87.5%、87.9%和83.2%,对尖孢镰刀菌番茄专化型的抑菌率分别为71.3%、75.8%和72.6%,对茄镰孢菌的抑菌率分别为87.5%、88.8%和86.5%。稀释10 000倍的B3、FA和FB对3种病原菌依旧有很高的抑菌率,对尖孢镰刀菌黄瓜专化型的抑菌率分别为65.3%、68.5%和65.3%,对尖孢镰刀菌番茄专化型的抑菌率分别为71.3%、75.8%和72.6%,对茄镰孢菌的抑菌率分别为78.0%、84.5%和79.5%。随着稀释倍数的增加,芽孢杆菌沼液肥对病原菌生长抑制效果减弱,其原因可能是稀释后有益微生物数量减少,对病原菌的竞争作用减弱。

图5 不同处理肥料对尖孢镰刀菌黄瓜专化型(a)、尖孢镰刀菌番茄专化型(b)和茄镰孢菌(c)生长的影响Fig.5 Effects of different fertilizers on the growth of F. oxysporum f.sp.Cucumerinum (a)、F. oxysporum f. sp. lycopersici (b) and F. solani (c)

图6 不同处理肥料对尖孢镰刀菌黄瓜专化型(a)、尖孢镰刀菌番茄专化型(b)和茄镰孢菌(c)生长的抑制效果Fig.6 Inhibitory effect of different fertilizers on the growth of F. oxysporum f.sp.Cucumerinum (a)、F.oxysporum f. sp.lycopersici (b) and F. solani (c)

此外,含芽孢杆菌的沼液肥存放1个月后活菌数减少,与现配现用的含芽孢杆菌沼液肥相比对病原菌的生长抑制作用降低,但依旧具有较高的抑菌率。存放1个月的含芽孢杆菌的沼液肥对尖孢镰刀菌黄瓜专化型、尖孢镰刀菌番茄专化型和茄镰孢菌的抑菌率与现配现用的沼液肥相比分别仅下降4.8%、4.2%和6.0%。因此添加芽孢杆菌可以显著提高沼液肥的抑菌效果。

3 讨 论

沼液中含有的赤霉素和有机酸等活性物质可以促进种子的发芽[23],以肥料形式施入土壤后,能促进植物的生长。王远远等[24]发现施用沼液能增加小白菜的叶宽和叶片数,产量增加97.74%,Yu等[25]发现沼液浇灌果树可以促进叶子生长提高果实的品质和产量,这与本试验中1 000倍稀释液芽孢杆菌沼液肥的促生结果相符合。本研究通过种子发芽试验快速验证了含芽孢杆菌沼液肥的促生效果,发现稀释250和500倍的芽孢杆菌沼液肥对黄瓜、小麦和白菜种子的萌发和生长具有抑制效果,而稀释1 000倍的含芽孢杆菌沼液肥则具有协同增效作用,可以显著促进种子的萌发和生长。沼液浓度过高可能是导致这一现象的重要原因,沼液中铵态氮过量会对作物造成铵毒害,抑制作物的生长[26]。此外,芽孢杆菌的产IAA能力是衡量其促生功能的重要指标,本研究采用的枯草芽孢杆菌的产IAA能力通过Salkowski比色法测定为38.8 mg/L,因此添加了芽孢杆菌的浓缩沼液对种子的促生效果显著提升。含芽孢杆菌沼液肥存放30 d后活菌数减少,但在本研究中,其对种子萌发和生长与现配现用的含芽孢杆菌沼液肥没有显著差异。

沼液中所包含的有机酸成分,植物激素中的赤霉素、乙酸和维生素B12等对病原菌有显著的抑制效应。关于沼液抑菌的相关研究表明,沼液可以显著抑制植物病原菌的孢子在体内萌发、菌丝在体外的生长以及分生孢子的形成等[27]。冯自立等[28]研究发现,采用浓缩沼液对棉花进行灌根处理,可以诱导棉花叶片活性氧爆发,增强过氧化物酶、几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、杜松烯合酶、苯丙氨酸解氨酶和多酚氧化酶基因的表达,从而抑制棉花黄萎病菌在植物体内的存活和扩展。本研究中,单独施用稀释后的浓缩沼液,对病原菌的抑菌率为50.0%～65.0%,抑菌率随着沼液稀释倍数的增加而降低。此外,相关研究也表明沼液中的铵和腐植酸可能是其主要的抑菌因子[7]。腐植酸有利于土壤中有益微生物的生长繁殖,对病原微生物有抑制作用,从而降低作物土传病害的发生[29];含氮量高的有机物料施入土壤后,因氨化作用会使土壤pH暂时性升高,导致土壤中NH3的浓度快速升高,因此可以有效杀灭病原菌[30]。

芽孢杆菌是一种具有广泛抑菌作用的生防菌。Gowtham等[31]研究发现,解淀粉芽孢杆菌显著增强了辣椒植株对炭疽病的防御作用,并且有效促进了辣椒生长。Cao等[32]研究表明,芽孢杆菌所产生的伊枯草菌素(Iturin)能够有效抑制尖孢镰刀菌的生长。张德珍等[33]发现淀粉芽孢杆菌JF-1对多种植物病原真菌产生明显的抑菌作用,能有效降低苗期黄瓜枯萎病的发病率和病情指数。郭珺等[34]发现芽孢杆菌Pb-4菌株对番茄枯萎病菌、黄瓜枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、青椒枯萎病菌、辣椒疫霉病菌和苹果腐烂病菌均有抑制作用,其抑菌活性具有广谱性。本研究中所采用的解淀粉芽孢杆菌的1 000倍稀释液对尖孢镰刀菌黄瓜专化型、尖孢镰刀菌番茄转化型和茄镰孢菌的抑制作用均在80.0%以上,具有较高的抑菌率,与前人的研究结果相一致。

本研究将浓缩沼液与芽孢杆菌进行复配后,对尖孢镰刀菌黄瓜专化型、尖孢镰刀菌番茄专化型和茄镰孢菌的抑制效果均高于单独施用芽孢杆菌菌液或浓缩沼液,显著提高了对病原菌的抑菌率。含芽孢杆菌沼液肥的10 000倍稀释液仍具有很高的抑菌作用,对3种病原菌的抑菌率均高于80.0%。随着稀释倍数的增大,对3种病原菌的抑菌率呈现下降趋势。但由于菌液稀释后仍含有大量的芽孢杆菌,对病原菌依旧具有60.0%以上的抑菌率。此外,本研究仅采用种子发芽试验和皿内抑菌试验探究了芽孢杆菌沼液肥的促生抑病功能,还需在大田环境下对其作用效果、用量和作用机理进行深入探究和论证。

4 结 论

本研究将芽孢杆菌添加到浓缩沼液中,明确了芽孢杆菌活菌数随着存放时间的增加而减少,存放90 d后活菌数仍满足国家对于复合微生物肥料中活菌数量的规定(5×107CFU/mL)。与对照或单独施用沼液相比,含芽孢杆菌沼液肥的1 000倍稀释液能不同程度的提高种子的6项发芽特征指标,显著促进了黄瓜、小麦和白菜种子的萌发和生长;含芽孢杆菌沼液肥可显著提高对尖孢镰刀菌黄瓜专化型、尖孢镰刀菌番茄专化型和茄镰孢菌的抑制作用。存放30 d的芽孢杆菌沼液肥的10 000倍稀释液对本试验中的3种病原菌的抑菌率仍在65.0%以上。因此,芽孢杆菌和浓缩沼液复配后对种子萌发的促进和对病原菌的抑制具有协同增效作用。