水产疫苗的细胞因子免疫佐剂研究及应用

王啸宇，蒋昕彧，周勇，曾令兵，孔祥会

（1.河南师范大学水产学院，水产动物疾病防控河南省工程实验室，河南 新乡 453007；2.中国水产科学研究院长江水产研究所，湖北 武汉 430223）

细胞因子（Cytokine,CK）是一类由免疫系统或造血系统中活化的细胞分泌的一类具有广泛生物活性的低分子质量蛋白或多肽。细胞因子可分为白细胞介素（Interleukin,IL）、干扰素（Interferon,IFN）、肿瘤坏死因子（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、集落刺激因子（Colony-stimulating factor,CSF）、趋化因子（Chemokines）和生长因子（Growth factor）。自1957 年IFN 被发现以来，已陆续有200 多种细胞因子被发现，它们与相应的受体结合，通过自分泌、旁分泌或内分泌的方式，发挥调节免疫应答、促进免疫细胞增殖分化、参与组织修复等免疫学功能。

免疫佐剂（Adjuvant）简称佐剂，即非特异性免疫增生剂，可以同抗原一起或预先注入机体并增强免疫保护效果的辅助物质。传统佐剂因为自身诸多缺点，比如弗氏佐剂不能被鱼体代谢，容易发生脓肿、溃疡和发热等副反应；而铝盐佐剂容易引起鱼体发生局部脓肿，引起过敏性反应。对鱼体的毒副作用以及佐剂效应弱等限制了其在渔用疫苗中的广泛应用，所以需要研发更加安全、高效和经济的新型佐剂。细胞因子具有免疫调节、参与炎症反应、促进造血与组织修复等多种生物学功能，使其成为目前免疫学研究中具有广泛应用前景的新型佐剂之一。本文对可作为疫苗佐剂的细胞因子类型、特征及作用进行综述，旨在为新型免疫佐剂的研发和应用提供依据。

1 细胞因子作为疫苗佐剂的免疫增强作用

细胞因子作为一类具有广泛生物学效应的小分子蛋白质，能在免疫的不同阶段调节机体的免疫应答。已发现，哺乳动物的同种细胞因子行使的功能并不单一；不同细胞因子之间具有协同性、拮抗性、多效性、重叠性和级联诱导的效应[1]。

目前，渔用疫苗佐剂的研究仍然是参考人类以及畜牧类动物的相关研究。Cox 等归纳了哺乳动物佐剂的五种作用模式：（1）免疫调节作用，指佐剂调节细胞因子功能网络的能力。不同的佐剂诱导抗原递呈细胞分泌不同的细胞因子，促进Th 前体细胞向Th1/Th2 亚型分化；（2）抗原递呈作用，指佐剂保持抗原构象完整并递呈给适当免疫效应细胞的能力，佐剂可影响APC（Antigen-presenting cell,APC）递呈抗原和分泌IL-1、诱导Th1/Th2 转换、协助B细胞记忆和提高抗体亲和力等；（3）诱导CD8+毒性T 细胞（Cytotoxic T lymphocyte,CTL）应答，通过与细胞膜融合或保护抗原肽，佐剂可促进抗原肽与MHCⅠ类分子结合，同时诱导IFN-γ 和TNF-α 的合成分泌，进而提高MHC Ⅰ类分子的表达；（4）靶向作用，指佐剂通过增强APC 摄取和递呈抗原的能力，进而获得足量的免疫原以达到预期的免疫效果；（5）抗原贮存作用，以铝佐剂和油包水佐剂为代表的短期贮存，可将抗原捕获在注射部位免受肝脏清除，如合成多聚体微球可长期贮存抗原的佐剂，可贮存抗原并持续提供和脉冲式将其释放[2]。

2 鱼类Th0 型细胞因子作为疫苗佐剂

2.1 IL-1β

1984 年首次克隆IL-1β 以来，对其生物学活性的研究极大加深了对疾病机制的理解[3]。IL-1β来源广泛，可由单核细胞、巨噬细胞和树突状细胞等多种细胞产生。研究表明，IL-1β 是重要的趋化因子和促炎性细胞因子，能够在级联反应中发挥作用，也是一种多效应细胞因子，能在不同免疫应答过程中发挥不同功能[4,5]。哺乳动物的IL-1β 属于非经典分泌蛋白（Unconventional Protein Secretion，UPS），即蛋白质的分泌不依赖于ER-Golgi 途径[6]。大多数UPS 蛋白不具有典型的信号肽，香鱼（Plecoglossus altivelis）、虹鳟（Oncorhynchus mykiss）、斑马鱼（Danio rerio）中IL-1β 氨基酸序列均不具有信号肽，但在其单核/巨噬细胞上清液中发现了IL-1β[7]。

1999 年在虹鳟中首次报道了鱼类IL-1β 基因，之后在其他鱼类中陆续克隆鉴定出。目前，IL-1β 是鱼类中研究最多的细胞因子之一。大量研究证明，IL-1β 在先天免疫应答调节过程中发挥重要作用，在病原入侵后可迅速做出反应并引发机体炎症反应[8,9]。硬骨鱼IL-1β 重组蛋白可以诱导免疫细胞的增殖和促炎细胞因子表达[10]。Wang 等[11]在斑点叉尾（Ictalurus punctatus）腹腔注射IL-1β蛋白后，发现重组IL-1β 可以提高机体抗体效价、血清杀菌活性、溶菌酶活性、以及内源性IL-1β 和TNF-α 在头肾和脾脏中的表达。Hong 等在虹鳟腹腔注射重组IL-1β 蛋白后，能够上调IL-1β 和cox-2 的mRNA 表达水平，增强淋巴组织中溶菌酶的活性，增强机体抵御病原感染的能力，降低死亡率。随着IL-1β 作为疫苗佐剂的研究逐步开展，阐明了免疫活性。Yin 等[12]用原核表达IL-1β 重组蛋白与使用甲醛灭活的嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）共同免疫鲤。结果显示与对照组相比，IL-1β 可以提高机体血清抗体效价，且无组织损伤和溃烂等副作用，具有较好的佐剂效应。IL-1β 重组蛋白与哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）全菌灭活疫苗经腹腔注射，共同免疫尖吻鲈（Lates calcarifer），结果显示IL-1β 能够提高哈维氏弧菌灭活疫苗的免疫效果[13]。Buonocore 等用原核表达IL-1β 成熟肽作为佐剂，与鳗弧菌（Vibro anguillarum）疫苗共同免疫欧洲舌齿鲈（Dicentrarchus labrax），结果显示鱼体内特异性抗体效价提高。IL-1β 作为免疫佐剂与迟缓爱德华氏菌（Edwardisella tarda）亚单位疫苗rOmpv 混合注射褐牙鲆（Paralichthys olivaceus），结果褐牙鲆的特异性血清抗体效价明显增加，头肾、脾脏和外周血sIg+淋巴细胞数量明显增多，免疫相关因子MHCⅠα、MHCⅡα、CD4-1、CD8α、CD4-2、CD8β、IgM 和IFN-γ 表达水平升高，相对存活率（Relative percentage survival,RPS）为71%，表现出显著的佐剂效应[14]。

2.2 IL-8

IL-8 首次在人类中发现，来源广泛的细胞因子，可由上皮细胞、成纤维细胞、单核/巨噬细胞、嗜中性粒细胞和肝细胞分泌，属于CXC 趋化因子亚家族。研究显示，哺乳动物的IL-8 在调节先天免疫应答、炎症反应、机体损伤和修复中发挥重要作用[15]。IL-8 还表现出一系列介导炎症和免疫反应的生物效应，如调节细胞因子分泌，促进淋巴细胞增殖和迁移，抵抗细菌或病毒感染，所以IL-8 具有作为疫苗佐剂的潜在应用价值。到目前为止，IL-8 基因已在多种硬骨鱼中被克隆鉴定出来，是鱼类中研究最多的细胞因子之一[16]。

1999 年最早在七鳃鳗（Lampetra japonicum）中克隆并鉴定了IL-8 基因[17]，之后在斑马鱼[18]、红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）[19]、草鱼（Ctenopharyngodon idella）[20]和鳙（Aristichthys nobilis）[21]等多种鱼类中被相继克隆鉴定。但是，关于鱼类IL-8 作为免疫佐剂的研究较少，仅在虹鳟、褐牙鲆和斑点叉尾鮰中发现[22]。Jimenez 等[23]发现，虹鳟IL-8 能够上调脾脏中促炎性细胞因子的表达，IL-8 作为免疫佐剂能够上调CK7、CK5B 等CC 型趋化因子的表达水平。Wang 等[24]通过构建真核质粒pcDNA3.1-IL-8（pcIL-8）与编码α-烯醇化酶（pcENO）的DNA 疫苗混合注射褐牙鲆，提高了褐牙鲆先天免疫能力和特异性抗体效价，并诱导促炎反应、体液免疫和细胞免疫的相关基因表达。此外，pcIL-8 增强了pcENO 的免疫保护作用，明显高于对照组。Guo 等[14]利用pcIL-8 真核质粒与迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗rOmpv 混合注射褐牙鲆，增强了rOmpv 诱导的体液和细胞免疫应答，有效提高褐牙鲆抗迟缓爱德华氏菌感染的能力，表明IL-8 分子可以作为迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗的免疫佐剂。

2.3 G-CSF

G-CSF 属于集落刺激因子（CSF）家族，主要由单核细胞、成纤维细胞及内皮细胞分泌，能够促进嗜中性粒细胞和单核/巨噬细胞的增殖和分化[25]。Santos 等[26]在褐牙鲆、红鳍东方鲀以及绿河鲀（Tetraodon nigroviridis）中克隆了G-CSF 基因。随后，在许氏平鲉（Sebastes schlegelii）[27]、斑马鱼[28]以及条石鲷（Oplegnathus fasciatus）[29]中也发现了G-CSF基因。目前，在鱼类中关于G-CSF 的研究多聚焦于病原体刺激或病原感染过程中G-CSF 发挥的功能，G-CSF 基因在组织和细胞中的转录水平变化。相关研究结果显示，G-CSF 在抵御病原微生物入侵的免疫反应中发挥重要作用。Santos 等[26]在褐牙鲆中发现，G-CSF 在头肾、鳃和脾脏等重要免疫器官中表达，暗示其参与了鱼类免疫应答。随后，Santos 等[26]用LPS、ConA 和PHA 分别刺激褐牙鲆头肾和外周血白细胞，G-CSF 的mRNA 表达水平上调。关于G-CSF 作为佐剂的效应研究已有报道。Kaur 等[30]发现，用G-CSF 作为人类免疫缺陷病毒（HIV）DNA 疫苗的佐剂，可增强小鼠血清IgG2a/IgG1 抗体比例。Guo 等[24]构建重组质粒pc-DNA-G-CSF（pcG-CSF）与迟缓爱德华氏菌亚单位疫苗rOmpv 混合注射褐牙鲆，显著提高了血清特异性抗体效价和sIg+淋巴细胞数量，促进细胞免疫和体液免疫相关基因表达上调，pcG-CSF 组RPS 也明显高于对照组，显示G-CSF 作为牙鲆迟缓爱德华氏菌疫苗佐剂具有显著效果。

2.4 TNF-α

TNF-α 是一种多效应细胞因子，在炎症和病原感染过程中发挥重要作用。在硬骨鱼类中存在两种类型的TNF-α，分别为TNF-α1 和TNF-α2[31]。TNF-α 由多种细胞产生，通过增强多种细胞反应，如细胞凋亡、吞噬作用和效应分子（IL-1、IL-6、IL-8和其他细胞因子）的产生来清除细菌和病毒[32]。在哺乳动物中，证实了TNF-α 对牛疱疹病毒（Bovine herpesvirus）、人类免疫缺陷病毒以及口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FDMV）均能增强机体免疫应答，提升机体抗病毒感染能力[33]。

TNF-α 在鱼类中被相继克隆鉴定，包括斑马鱼[34]、草鱼[35]、虹鳟[36]、鲤[37]、金头鲷（Sparus aurata）[38]、条石鲷[39]和褐牙鲆[40]。但关于TNF-α 作为渔用佐剂的研究仅在褐牙鲆中报道，Guo 等[14]构建了TNF-α 真核表达载体（pcTNF-α）与亚单位疫苗rOmpv 混合注射褐牙鲆，结果显示免疫相关基因MHCⅠα、CD8β、CD8α 和IFNγ 表达水平上调，但是，pcTNF-α 组血清抗体效价、sIg+淋巴细胞数量和RPS 与对照组相比无显著差异。表明TNF-α作为rOmpv 亚单位疫苗佐剂起到了一定的辅助作用，推测其针对病毒引发的适应性免疫发挥重要作用，并对病毒疫苗有显著的佐剂效应[41]。

2.5 IL-17

哺乳动物中IL-17 家族有六个成员（IL-17A～IL-17F），具有免疫调节、诱导细胞凋亡和促进炎症的作用。相关研究表明，IL-17 家族细胞因子，通过激活NF-κB 信号通路发挥抗病毒作用[42]。鱼类的IL-17 家族基因已在多种鱼类中被克隆鉴定，如斑马鱼[43]、河鲀[44]、鲑（Oncorhynchus keta）[45]、虹鳟[46]、草鱼[47]、斑点叉尾[48]和大黄鱼（Larimichthys crocea）[49]。Cao 等[50]通过混合注射pcDNA-IL-17（pcIL-17）与虹鳟IHNV（pG）DNA 疫苗来评估佐剂效果。结果显示，pcIL-17 作为佐剂能够提高IgM 和CD8 表达，且特异性抗体效价高于对照组。pcIL-17还提高了RPS 和sIg+淋巴细胞数量。综上所述，IL-17 作为疫苗佐剂可以增强IHNV 疫苗的免疫效果。

3 鱼类Th1 型细胞因子作为疫苗佐剂

3.1 IL-2

IL-2 最初命名为T 细胞生长因子（TCGF），合成和分泌主要由Th 细胞被抗原或某些有丝分裂剂如伴刀豆凝集素（ConA）、植物凝集素（PHA）或由于T 细胞受体与抗原呈递细胞表面的MHC 复合物的相互作用而产生[59]。研究表明，IL-2 具有多种生物学功能：激活NK 细胞[60]；免疫球蛋白（Ig）J 链，以及Ig 的合成与分泌[61]；在抗原刺激后激活细胞毒性淋巴细胞克隆，诱导细胞因子的产生。目前，IL-2 在移植排斥、抗肿瘤、抗感染、免疫缺陷等临床治疗中发挥重要作用[62]。

在哺乳动物中证实IL-2 作为疫苗佐剂在细菌、病毒和寄生虫感染中能增强疫苗免疫应答的强度。Diaz-Rosales 等[63]发现，重组虹鳟IL-2 蛋白能够促进转录因子Blimp-1 和STAT5 表达，而这两个转录因子具有诱导B 细胞分化为浆细胞的能力，推测IL-2 能够增强机体的免疫反应。将构建的真核表达系统pcDNA-IL-2（pcIL-2）与比目鱼杆状病毒（HIRRV）混合注射褐牙鲆，与对照组相比pcIL-2组β-防御素、CD4-1、CD8α、IFN-γ 和TNF-α表达上调，RPS 升高[52]。Cao 等[58]利用虹鳟IHNV（pG）DNA 疫苗与pcIL-2 混合注射，结果表明，IL-2能够提高IgM 和CD8 的表达水平，抗体效价显著高于对照组。pcIL-2 还提高了RPS 和sIg+淋巴细胞数量。因此，该细胞因子具有作为疫苗佐剂的潜力。

3.2 IFN-γ

IFN 是脊椎动物抵御病原入侵的天然防御因子，在先天免疫应答中发挥重要作用，分为Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型[64]。IFNγ 是Ⅱ型IFN，主要由NK 细胞和T 淋巴细胞分泌，其应答受到多种活性物质（信号分子、炎症介质和转录活性因子）调控[65]。IFN-γ 通过调控先天性和适应性免疫应答中的效应细胞,进而提高机体免疫细胞对病原体的应答速度。IFN-γ 除了发挥抗病毒的功能以外，还能调控抗原识别和递呈过程中MHC 分子的表达[66]。

表1 细胞因子作为鱼用疫苗佐剂的研究概况[51]Tab.1 Summary of cytokines as adjuvants of fish vaccines

IFN-γ 的佐剂效应在哺乳动物中已得到广泛证实，但关于鱼类IFN-γ 佐剂效应的研究却十分有限。Cai 等[67]将褐牙鲆IFN 调节因子作为真鲷（Pagrus major）虹彩病毒DNA 疫苗免疫佐剂，增强了真鲷血清特异性抗体效价，并诱导抗病毒相关基因表达上调。

4 鱼类Th2 型细胞因子作为佐剂

IL-6 是一种多功能细胞因子，在炎症反应、免疫调节、组织再生和造血中发挥重要作用，并在机体的抗感染免疫中起重要作用[68]。此外，IL-6 可调节B 细胞分化为浆细胞[69]。

IL-6 作为多功能细胞因子，在哺乳动物中作为佐剂被广泛应用，但在鱼类中只在草鱼、褐牙鲆和红笛鲷（Lutjanus sanguineus）中有报道。Yan 等[70]构建了pcDNA-IL-6-VP6（pcIL-6-VP6）融合表达载体，并用脂质体转染草鱼CIK 细胞，结果显示，pcIL-6-VP6 质粒能在CIK 细胞中高效表达，为DNA 疫苗免疫效果的检测奠定了坚实的基础。Guo等[56]通过构建pcDNA-IL-6（pcIL-6）和重组蛋白IL-6（rIL-6）分别与重组亚单位疫苗rOmpV 混合注射褐牙鲆。结果显示，与对照组相比，接种rOmpV+pcIL-6 或rIL-6 的褐牙鲆RPS 明显升高，外周血、头肾和脾脏中的sIg+淋巴细胞数量增加，接种pcIL-6 和rIL-6 的褐牙鲆免疫相关基因IL-1β、TNF-α、CD8α、CD4-1、MHCⅡα 和MHCⅠα 表达水平上调。rIL-6 与pcIL-6 作为佐剂，二者相比，rIL-6 组血清抗体效价、sIg+淋巴细胞数量和免疫相关基因（IL-1β、TNF-α、CD4-1 和MHCⅡα）表达量明显增加。Huang 等[71]构建了融合表达载体pcDNA-IL6-OmpV，注射红笛鲷后得到与Guo等相似的结果，IL-6 作为疫苗佐剂，其血清抗体效价和RPS 均明显高于对照组。鱼类中，目前尽管已有较多关于IL-6 功能的研究，但涉及IL-6 作为佐剂的效应研究仍处于起步阶段。

5 总结与展望

随着水产养殖业的不断发展，由病原微生物引起的鱼类疾病已成为限制水产养殖业发展的颈瓶。目前，鱼类疾病控制主要采用化学渔药和注射渔用疫苗。但当前水产养殖中使用的药物，含有大量的抗生素和重金属成分，对水产养殖和消费者带来巨大安全隐患。而渔用疫苗被认为是预防鱼病的最有效方法，且健康环保。越来越多的新型疫苗，如亚单位疫苗、核酸类疫苗以及合成肽疫苗等已应用于实际生产，但由于基因工程疫苗免疫原性较弱，使用佐剂才能有效提高鱼体的免疫保护效果。而传统佐剂包括铝盐和弗氏佐剂是水产养殖中已知最有效的佐剂，但由于其佐剂效应差、持续时间短和副作用多等缺点，所以需寻找一些高效的免疫佐剂替代，而细胞因子作为免疫佐剂则可改善上述问题。细胞因子能够调节免疫应答、促进血细胞生成、诱导细胞增殖分化以及参与组织修复等多种生物学功能，成为目前免疫学中最具前景的佐剂候选者之一。然而，细胞因子表现出与剂量相关的毒性，免疫原性弱而不能有效刺激机体免疫应答以及稳定性差、半衰期短且经济成本较高等问题，阻碍了其在生产中的应用。目前，这些问题正在得到逐步解决，例如，将细胞因子基因连接到免疫原蛋白基因上，DNA 分子融合表达成融合蛋白，或联合多种细胞因子和趋化因子混合使用，提高单一佐剂的免疫效果。从长远来看，需要在佐剂的基础研究和应用研究方面加大投入，以促进我国水产养殖产业健康可持续发展。