氯虫苯甲酰胺对中华绒螯蟹的急性毒性研究

吴松，黄晓丽，陶月，覃东立，陈中祥，郝其睿，高磊，王海涛，孙言春，王鹏，张颖

（1.中国水产科学研究院黑龙江水产研究所，黑龙江 哈尔滨 150070；2.东北农业大学资源与环境学院，黑龙江 哈尔滨 150030；3.黑龙江省黑土保护与修复重点实验室，黑龙江 哈尔滨 150030；4.农业农村部水产品质量安全风险评估实验室，黑龙江 哈尔滨 150070）

近年来，水稻与水产养殖动物互利共生的稻渔综合种养的生态养殖模式在我国各地蓬勃发展[1]，稻渔综合种养的规模和水产品产量不断提升[2]。据统计，2020 年中国稻田养殖总面积为253 ×104hm2，水产品产量达325×104t[3]。稻蟹养殖是稻渔综合种养的主要模式之一。2020 年，全国稻蟹的产量为6.32×104t，养殖面积为12.7×104hm2，仅次于稻虾和稻鱼综合种养，位居全国第三位[2,3]。目前，我国的稻蟹综合种养模式中几乎全部以中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）作为养殖对象[4]。随着中华绒螯蟹的养殖规模和市场需求的逐年增大，其养殖条件和质量安全也得到越来越多的关注[5-8]。在水稻种植过程中，为了防治杂草和病虫害而施用除草剂和杀虫剂，这些农药可能影响稻田养殖的水产动物和水产品产量及质量[9,10]。因此，研究稻田施用农药对蟹的毒性效应十分必要。

不同种类农药对中华绒螯蟹的毒性效应不同。长时间暴露在氟虫腈[5]、辛硫磷[10]、吡虫啉[10]和敌百虫[11]等杀虫剂下，中华绒螯蟹会出现中毒症状。陈尚朝等[12]研究了两种有机磷类杀虫剂对中华绒螯蟹的毒性作用，发现部分有机磷类药物可以降低中华绒螯蟹的代谢活动，影响长发育。施用有机磷药物会抑制处于生长期的中华绒螯蟹的耗氧量及排氨量，降低其代谢水平。草酮、氰氟草酯和苄嘧磺隆·丙草胺3 种除草剂在中华绒螯蟹稻田间推荐用量5～6 倍浓度下，未见急性中毒反应[13]。苯噻酰草胺[14]和草甘膦[15]可显著影响中华绒螯蟹免疫指标。氯虫苯甲酰胺（Chlorantraniliprole），俗称“康宽”，是是我国稻田最常用的高效双酰胺类杀虫剂[16-19]，对防治稻田小菜蛾[20]、二化螟[21]、瓢虫[22-23]和大型水蚤[24]等效果显著。近年来，已开展了氯虫苯甲酰胺对鲤（Cyprinus carpio）、克林雷氏鲶（Rhamdia quelen）等水产动物的毒性效应的研究[25,26]，但对中华绒螯蟹的研究尚未见报道。

东北地区稻蟹综合种养模式发展较快，以辽宁为代表，养殖面积达13×104hm2[2]。本研究以东北地区稻田养殖的中华绒螯蟹幼蟹和成蟹为研究对象，开展了氯虫苯甲酰胺对中华绒螯蟹幼蟹和成蟹的急性毒性实验，以掌握该农药对中华绒螯蟹的损害程度，评价其对中华绒螯蟹的安全性，为稻渔综合种养过程中的合理用药提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

实验用中华绒螯蟹幼蟹体质量（21.32±2.10）g和成蟹（87.32±9.20）g（以下简称幼蟹和成蟹）于2021 年6 月购自辽宁省盘锦市盘山县胡家镇养殖场，在中国水产科学研究院黑龙江水产研究所养殖车间使用曝气自来水暂养一周。暂养期间平均水温（22±2）℃，pH 为6.85～7.46，投喂浸泡好的碎玉米粒。暂养结束后随机选取规格统一、健康无病、附肢齐全的成蟹和幼蟹进行急性毒性实验。

氯虫苯甲酰胺悬浮剂（20%）购买自富美实（中国）投资有限公司，详细信息见表1；二甲基甲酰胺为分析纯，购买自国药集团化学试剂有限公司；便携式水质测定仪（YSI 2030，美国）。

表1 实验用杀虫剂基本信息Tab.1 Basic information on the test pesticide

1.2 方法

急性毒性实验在长50 cm、宽40 cm、高40 cm（实际盛水20 L）的玻璃鱼缸中进行。实验用水为曝气自来水。采用静水式体外暴露法[16]。实验期间不投喂，水温20℃～25℃、pH6.75～7.36，水体溶解氧（DO）含量保持在5.5 mg·L-1以上。预实验确定成蟹的24 h 全死亡浓度（3 000 mg·L-1）和96 h 无死亡浓度（50 mg·L-1）。在50～3 000 mg·L-1的浓度之间，按照等比级数设6 个浓度梯度（表2）。同时确定幼蟹的24 h 全死亡浓度（3 500 mg·L-1）和96 h 无死亡浓度（75 mg·L-1）。在75～3 500 mg·L-1之间，按照等比级数设6 个浓度梯度（表2）。设置曝气自来水空白对照组和二甲基甲酰胺助溶剂对照组，每个浓度组设4 个平行。每个玻璃缸投放6 只中华绒螯蟹，以96 h 为一个实验周期，每24 h 更换一次实验溶液。实验开始后，定时观察实验蟹的存活状况，测定水体pH、DO 浓度和温度，记录实验蟹在24 h、48 h、72 h、96 h 时的行为变化和死亡情况，及时捞出死亡的实验蟹。

表2 氯虫苯甲酰胺对中华绒螯蟹的实验浓度Tab.2 Experimental concentration of chlorantraniliprole on Chinese mitten handed crab

1.3 数据处理

实验数据以平均值±标准偏差（X±SD）表示，利用SPSS 19.0 软件中单因素方差分析法（One-way ANOVA）分析不同药物浓度梯度间差异。当数据存在显著性差异时，利用Duncan 法进行多重比较。以P<0.05 差异显著水平，P<0.01 为差异极显著水平。半致死浓度（LC50）和安全浓度（SC）采用寇氏法[14]计算。

2 结果与分析

2.1 氯虫苯甲酰胺对成蟹的急性毒性

空白组和溶剂对照组中的成蟹未见异常反应，活力正常，说明助溶剂二甲基甲酰胺对实验结果没有影响。实验组中，随着暴露时间的延长，成蟹表现出不同程度的中毒现象。在50 mg·L-1浓度下，大多数成蟹无中毒症状，活力基本正常，仅个别成蟹游动变缓，中毒现象较轻；在113 mg·L-1浓度组，72 h后成蟹呈应激反应迟钝、抱团等中毒症状；257 mg·L-1和583 mg·L-1浓度组，48 h 后成蟹逐渐出现活力下降、抱团、附肢脱落、个体死亡等中毒现象。在3 000 mg·L-1浓度下，成蟹的中毒反应明显，12 h 内即出现烦躁不安、躯体抬升、四处逃窜等现象，随后逐渐趋于安静、部分附肢脱落，躯体僵直。用玻璃棒轻触，无明显反应，10 min 后再次触碰，仍无反应，即判定死亡。72 h 后90%以上的个体死亡。

成蟹的死亡数与氯虫苯甲酰胺浓度具明显的时间-效应和剂量-效应关系。随着氯虫苯甲酰胺浓度的升高和暴露时间的延长，成蟹的存活率明显下降。24 h 时3 000 mg·L-1浓度组成蟹死亡率达25%，其他浓度组成蟹死亡率均低于15%。48 h 时，3 000 mg·L-1浓度组成蟹死亡率达62.5%，而其他浓度组成蟹死亡率为15%～30%，不同浓度组间存在极显著差异（P=0.0027）。96 h 后，小于583 mg·L-1浓度组中成蟹死亡率均≤50%，1 323 mg·L-1浓度下死亡率达91.67%，不同组的死亡率存在显著差异（P=0.0130）。而3 000 mg·L-1浓度下，成蟹全部死亡。氯虫苯甲酰胺对中华绒螯蟹成蟹的24 h、48 h、72 h、96 h 的LC50分别为2 371 mg·L-1、1 222 mg·L-1、727.8 mg·L-1和286.4 mg·L-1；安全浓度为28.6 mg·L-1（表3）。

表3 氯虫苯甲酰胺对中华绒螯蟹成蟹的急性毒性Tab.3 Acute toxicity of chlorantraniliprole to adult Chinese mitten handed crab

2.2 氯虫苯甲酰胺对幼蟹的急性毒性

幼蟹对氯虫苯甲酰胺的反应与成蟹略有不同。药物暴露初期，幼蟹中毒症状较成蟹轻。在75 mg·L-1浓度组中，整个暴露过程中绝大多数幼蟹无中毒症状，活力正常，仅有个别幼蟹出现了游动变缓的疑似中毒现象；349 mg·L-1和752 mg·L-1浓度组中的幼蟹暴露72 h 后逐渐出现游动活力下降、附肢部分脱落等中毒现象。在3 500 mg·L-1浓度下，氯虫苯甲酰胺对幼蟹具有明显的毒性作用，中毒症状与成蟹相似，24 h 内即出现烦躁不安、躯体抬升、四处逃窜等现象。随后，幼蟹趋于安静，眼睛轻微晃动，轻触碰后并无明显反应，直至死亡。死亡的幼蟹眼睛呈灰白色，体色变浅。72 h 后80%以上的个体死亡，较同阶段成蟹的死亡率低约10%。

幼蟹的死亡率与氯虫苯甲酰胺浓度呈正相关。随着氯虫苯甲酰胺浓度的升高和暴露时间的延长，幼蟹的存活率逐渐下降。24 h 时，低于1 623 mg·L-1的浓度组，幼蟹死亡率均低于15%，而3 500 mg·L-1浓度组中，死亡率达25%。48 h 时，低于1 623 mg·L-1浓度组的幼蟹死亡率约30%，而3 500 mg·L-1浓度组幼蟹死亡率达62.5%；96 h 后，≤752 mg·L-1浓度组幼蟹死亡率≤40%，1 623 mg·L-1浓度组死亡率达87.5%，不同组的死亡率差异极显著（P=0.0011）。3 500 mg·L-1浓度组中，幼蟹全部死亡。通过分析得到：氯虫苯甲酰胺对幼蟹24 h、48 h、72 h 和96 h 的LC50分别为2 526 mg·L-1、1 900 mg·L-1、834.2 mg·L-1和552.7 mg·L-1；安全浓度（SC）为55.3 mg·L-1（表4）。

表4 氯虫苯甲酰胺对中华绒螯蟹幼蟹的急性毒性Tab.4 Acute toxicity of chlorantraniliprole to the juvenile Chinese mitten crab

2.3 氯虫苯甲酰胺对中华绒螯蟹幼蟹和成蟹的毒性比较和安全性评价

氯虫苯甲酰胺的田间常用施药量为0.02 mg·L-1（按照药物说明书折算），利用田间施药量与实验测得96 h-LC50的比值[27]可评价氯虫苯甲酰胺的毒性安全性。幼蟹的田间施药量/96 h-LC50的结果为4×10-5；成蟹的田间施药量/96 h-LC50的结果为8×10-5（表5），表明幼蟹比成蟹对氯虫苯甲酰胺的耐受性更强。

表5 氯虫苯甲酰胺对中华绒螯蟹幼蟹和成蟹的安全性评价Tab.5 The safety evaluation of chlorantraniliprole to the juvenile and adult Chinese mitten handed crab

大部分研究采用96 h-LC50来评价药物对水生动物的急性毒性大小。依照大型甲壳类生物96 h-LC50值，可将农药对大型甲壳类生物急性毒性划分为四个等级[28]：96 h-LC50≤0.1 mg·L-1为剧毒；0.1 mg·L-1<96 h-LC50≤1.0 mg·L-1为 高 毒；1.0 mg·L-1<96 h-LC50≤10 mg·L-1为中毒；96 h-LC50>10 mg·L-1为低毒。依据田间施药量与实验获得的96h-LC50比值来评价氯虫苯甲酰胺对中华绒螯蟹的毒性。田间施药量/96 h-LC50<0.1 为低风险；0.1<田间施药量/96 h-LC50≤1.0 为中等风险；1.0<田间施药量/96 h-LC50≤10 为高风险；田间施药量/96 h-LC50>10 为极高风险[27]。结合《化学农药环境安全评价试验准则》[28]和本实验结果可以得知，氯虫苯甲酰胺对中华绒螯蟹幼蟹和成蟹均属于低毒、低风险等级。

与吡虫啉、辛硫磷[10]、毒死蜱[12]等相比，在常用的稻田杀虫剂中，氯虫苯甲酰胺对中华绒螯蟹的毒性最小。陈尚朝等[29]研究发现，两种有机磷类杀虫剂（毒死蜱、硫丹）抑制了处于生长期的中华绒螯蟹耗氧量、排氨量及代谢水平，影响其生长发育。洪宇航[30]研究了除草剂草甘膦对中华绒螯蟹成蟹主要免疫指标影响。结果表明，草甘膦显著影响中华绒螯蟹总血细胞密度、血清中血蓝蛋白含量和酚氧化酶、酸性磷酸酶以及碱性磷酸酶活性。随着草甘膦浓度升高，影响越为明显，可造成部分免疫功能下降。可见，不同农药对不同养殖动物和不同发育时期的动物毒副作用也不同[27]。本实验结果表明，中华绒螯蟹幼蟹对氯虫苯甲酰胺的耐受能力强于成蟹。

氯虫苯甲酰胺与昆虫鱼尼丁受体亚型选择性结合，导致受体通道长期开放，使昆虫细胞内源Ca2+大量释放，从而引起昆虫肌肉收缩，停止进食，最终死亡[31,32]。总体而言，氯虫苯甲酰胺对养殖水产品的毒性较低，药物安全性较高，在合理的剂量下不会对常见养殖水产动物产生毒害作用。于振海等[33]测得，氯虫苯甲酰胺对克氏原螯虾的96 h-LC50为335.64 mg·L-1，介于本研究中中华绒螯成蟹和幼蟹的96 h-LC50之间。盛银平等[34]研究了氯虫苯甲酰胺对8 种常见淡水养殖鱼虾的急性毒性，结果表明该农药对鲤、鲫（拉丁名）等大多数鱼类为低毒。孟华清等[35]研究了氯虫苯甲酰胺对鲤鱼幼苗的急性毒性效应，结果显示氯虫苯甲酰胺对鲤鱼幼苗的96 h-LC50为130.4 mg·L-1。该研究结果表明氯虫苯甲酰胺对鲤鱼幼苗低毒。因此，结合本实验结果和上述学者的研究综合分析，氯虫苯甲酰胺在合理剂量下施用对稻田养殖中华绒螯蟹存活无明显影响。

氯虫苯甲酰胺对中华绒螯蟹低毒，在农业生产中正常使用对稻田养殖中华绒螯蟹无明显影响。但氯虫苯甲酰胺对其他对外界环境胁迫反应更为敏感的水产养殖动物的毒性，还有待进一步研究。