基于抗炎有效成分畲药树参茎质量标准的研究*

陈张金，余 乐，刘 敏，张晓芹，范 蕾，陈 梦，黄绳武，李建良，陈琴鸣，陈桂云

（1.丽水市质量检验检测研究院，浙江 丽水 323000；2.丽水市中医院，浙江 丽水 323000；3.浙江中医药大学，浙江 杭州 310053）

树参[Dendropanax dentiger (Harms) Merr.]为五加科树参属树参的灌木或乔木，用药历史悠久，被载录《中华本草》《中药大辞典》《全国中草药汇编》《中国畲族医药学》等书籍中，具有祛风除湿、活血消肿的功效，可用于治疗风湿病、关节炎、半身不遂等疾病，是我国江西和浙江一带使用频率较高的30种畲药之一[1-3]。树参的药用部位包括根、茎，其中树参茎曾作为医院制剂“枫荷梨”的君药被广泛应用于临床，疗效显著。但因饮片质量标准的缺失，“枫荷梨”制剂已停产，树参的临床应用受到限制。课题组在前期基于谱效关系对树参茎的抗炎药效成分开展了研究，结果表明树参茎中主要含有酚酸类、黄酮类、苯丙素类化合物[4]，其抗炎的作用是化学成分群共同作用的结果，其中异绿原酸C、绿原酸、紫丁香苷、异绿原酸A是树参茎抗炎的主要药效成分。研究表明，紫丁香苷等苯丙素类成分除具有抗炎活性外，还可抑制脂多糖（LPS）诱发的炎症反应[5-6]；绿原酸具有抗佐剂性关节炎的作用，并可通过降低血清肿瘤坏死因子（TNF-α）、白细胞介素-2（IL-2）、循环免疫复合物（CIC）和丙二醛（MDA）含量及提高抗氧化能力发挥作用[7]；甜叶菊废渣提取物中的异绿原酸类物质具有很好的抗炎效果[8]；绿原酸、异绿原酸B、异绿原酸A及异绿原酸C在20～100 μm浓度范围内对细胞均无毒性作用，且均有抗炎活性[9]。因此，本研究拟以抗炎有效成分为指标对畲药树参茎的鉴别、含量测定方法开展研究，并对水分、总灰分、浸出物进行控制，旨在为该畲药的开发应用奠定基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 1260型高效液相色谱仪，含DAD检测器（美国安捷伦公司）；XS105DU型电子天平（瑞士梅特勒公司）；DM2500型正置显微镜（德国徕卡公司)；Memmert UNE400型自然对流烘箱（德国Memmert 有限公司）；SK8210HP型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）；SXL-1008型程控箱式电炉（上海精宏实验设备有限公司）；硅胶H薄层板、硅胶G254薄层板（青岛海洋化工有限公司）。

1.2 试剂与试药 紫丁香苷对照品（批号：DST200912-012，含量：98.54%）、绿原酸对照品（批号：DSTDL002102，含量：99.56%）、异绿原酸A对照品（批号：DSTDY003601，含量：98.56%）、异绿原酸C对照品（批号：DSTDY003802，含量：99.58%）均购自德思特生物技术有限公司；甲酸、四氢呋喃、乙腈为色谱纯；氯仿、石油醚、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇、甲醇为分析纯；水为超纯水。

采集的12批树参茎样品经李建良副主任中药师鉴定为五加科树参属植物树参[Dendropanax dentiger (Harms) Merr.]干燥茎。具体信息见表1。

表1 树参茎样品信息表

2 方法与结果

2.1 显微鉴别 取过五号筛的供试品粉末，挑取少许置于载玻片上，滴加水合氯醛试液，加热透化后，盖上盖玻片，置显微镜下观察。结果粉末呈棕黄色；木纤维壁稍厚，孔沟和纹孔较明显，纹孔为具缘纹孔；木栓组织碎片细胞呈椭圆形，长方形或不规则形，壁厚，有的含棕色物；草酸钙簇晶较多，黄棕色，棱角较钝，直径10～25 μm；石细胞多成群散在，类方形、卵圆形或多角形，直径15～30 μm，壁较厚，孔沟细密，胞腔大；导管为具缘纹孔导管，类圆形，纹孔排列紧密；韧皮纤维长条形，末端稍尖或椭圆形，壁厚薄不一，有的胞腔具隔膜，孔沟较深，纹孔可见。（见图1）

图1 树参茎粉末显微鉴别图

2.2 薄层鉴别

2.2.1 紫丁香苷[10-12]取过四号筛树参茎粉末1 g，用60%乙醇25 mL超声提取1 h，提取液蒸干，用2 mL的乙醇溶解作为供试品溶液。另取紫丁香苷对照品，加甲醇制成1 mg/mL的紫丁香苷对照品溶液。依照2020年版《中华人民共和国药典》[13]薄层色谱法（通则0502）试验，吸取供试品溶液5～10 μL、紫丁香苷对照品溶液5 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，以三氯甲烷-甲醇-甲酸（体积比为6.0∶1.2∶0.5）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（254 nm）下检视。结果显示供试品色谱在与紫丁香苷对照品色谱相应的位置上，显相同的亮蓝色荧光斑点。（见图2）

图2 紫丁香苷薄层色谱鉴别图

2.2.2 绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C[14-15]取过四号筛的供试品粉末1 g，用60%乙醇25 mL超声提取1 h，提取液蒸干，用2 mL乙醇溶解作为供试品溶液。另取绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C对照品，加甲醇制成各成分质量浓度为1 mg/mL的混合对照品溶液。依照2020年版《中华人民共和国药典》[13]薄层色谱法（通则0502）试验，吸取供试品5～10 μL、混合对照品5 μL，分别点于同一硅胶H薄层板上，以乙酸丁酯-甲酸-水（体积比为7.0∶2.5∶2.5）为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯（365 nm）下检视。结果显示供试品色谱在与各对照品色谱相应的位置上，显相同的亮蓝色荧光斑点。（见图3）

图3 绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C 薄层色谱鉴别图

2.3 检查

2.3.1 水分 按2020年版《中华人民共和国药典》[13]水分测定法第二法（通则0832）检测，应不得过13.0%。结果见表2。

表2 树参茎检查结果

2.3.2 总灰分 按2020年版《中华人民共和国药典》[13]灰分测定法（通则2302）检测，应不得过5.0%。结果见表2。

2.3.3 浸出物 按2020年版《中华人民共和国药典》[13]浸出物测定法（通则2201），以60%乙醇为溶剂，热浸法检测，不得少于4.0%。结果见表2。

2.4 含量测定[4，16]

2.4.1 紫丁香苷、绿原酸[17-19]含量测定

2.4.1.1 色谱条件 以Waters sunfire TM C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）为色谱柱，以乙腈-混合水溶液（含0.2%甲酸和1.0%四氢呋喃）（7∶93）为流动相，检测波长为264 nm，柱温为30 ℃，进样量为5 μL，流速为1.0 mL/mim，分析时间为30 min。

2.4.1.2 混合对照品溶液的制备 精密称取紫丁香苷、绿原酸对照品适量，用50%甲醇稀释成每1 mL分别含紫丁香苷35.74 μg、绿原酸77.52 μg的混合对照品溶液。

2.4.1.3 供试品溶液的制备 取树参茎粉末（过四号筛）约2 g，精密加入50 mL 60%乙醇，称定质量，超声（功率：500 W，频率：53 kHz）1 h，放冷后再称定质量，用提取溶剂补足减失的质量，0.45 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.4.1.4 系统适用性试验 分别精密吸取紫丁香苷、绿原酸混合对照品溶液和供试品溶液，按“2.4.1.1”色谱条件进样，记录色谱图。（见图4）在该色谱条件下，两成分与其他成分的色谱峰的分离度均大于1.5，表明分离良好。

图4 HPLC 图

2.4.1.5 线性关系考察 精密称取紫丁香苷、绿原酸对照品适量至同一25 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解稀释成质量浓度分别为0.178 7、0.387 6 mg/mL的混合对照品溶液Ⅰ。精密吸取混合对照品溶液Ⅰ5 mL至25 mL容量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，得混合对照品溶液Ⅱ。精密吸取混合对照品溶液Ⅰ1、3、5 μL，混合对照品溶液Ⅱ2、3、5 μL按“2.4.1.1”色谱条件进样，以进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得紫丁香苷、绿原酸的回归方程分别为y=1 829.1x+3.503 2（r=0.999 8）、y=531.13x-5.373 2（r=0.999 8），表明紫丁香苷、绿原酸分别在0.035 7～0.894 0 μg、0.077 5～1.938 0 μg范围内线性关系良好。

2.4.1.6 精密度试验 取树参茎样品（编号为11）按“2.4.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.1.1”色谱条件连续进样6次，计算紫丁香苷、绿原酸峰面积的RSD分别为0.32%、0.12%，表明仪器精密度良好。

2.4.1.7 稳定性试验 取树参茎样品（编号为11）按“2.4.1.3”项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h按“2.4.1.1”色谱条件进样测定，计算紫丁香苷、绿原酸峰面积的RSD分别为1.99%、0.32%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.1.8 重复性试验 精密称取同一批树参茎样品（编号为11）按“2.4.1.3”项下方法制备供试品溶液6份，按“2.4.1.1”色谱条件进样测定含量，按干燥品计算紫丁香苷、绿原酸的含量分别为1.00、4.35 mg/g，RSD分别为0.61%、0.58%，表明方法重复性良好。

2.4.1.9 加样回收率试验 精密称取已知含量树参茎样品（编号为11）6份，按“2.4.1.3”项下方法制备供试品溶液，精密加入紫丁香苷、绿原酸对照品适量，按“2.4.1.1”色谱条件进样测定，计算回收率。结果显示紫丁香苷、绿原酸的平均加样回收率分别为98.52%、99.83%，RSD分别为0.57%、0.57%。（见表3）

表3 紫丁香苷、绿原酸加样回收率试验结果

2.4.1.10 样品含量测定 取不同编号树参茎样品，取按“2.4.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.1.1”色谱条件进样分析，按干燥品计算紫丁香苷、绿原酸含量。（见表4）根据测定结果制定限度：按干燥品计，含紫丁香苷应不低于0.010%，含绿原酸应不低于0.075%。

表4 含量测定结果汇总表

2.4.2 异绿原酸A、异绿原酸C[20-21]含量测定

2.4.2.1 色谱条件 以Waters sunfire TM C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）为色谱柱，以乙腈-水溶液（含0.2%甲酸和1.0%四氢呋喃）（20∶80）为流动相，检测波长为328 nm，柱温为30 ℃，进样量为5 μL，流速为1.0 mL/mim，分析时间为25 min。

2.4.2.2 混合对照品溶液的制备 精密称取异绿原酸A、异绿原酸C对照品适量，用50%甲醇稀释成每1 mL分别含异绿原酸A 44.56 μg、异绿原酸C 24.68 μg的混合对照品溶液。

2.4.2.3 供试品溶液的制备 方法同“2.4.1.3”。

2.4.2.4 系统适用性试验 分别精密吸取异绿原酸A、异绿原酸C混合对照品溶液和供试品溶液，按“2.4.2.1”色谱条件进样，记录色谱图。（见图5）在该色谱条件下，两成分与其他成分色谱峰的分离度均大于1.5，表明分离良好。

图5 HPLC 图

2.4.2.5 线性关系考察 精密称取异绿原酸A、异绿原酸C对照品至同一100 mL容量瓶中，用50%甲醇溶解稀释成为质量浓度分别为0.111 4、0.061 7 mg/mL的混合对照品溶液Ⅰ。精密吸取混合对照品溶液Ⅰ5 mL至25 mL容量瓶中，用50%甲醇稀释至刻度，得混合对照品溶液Ⅱ。精密吸取混合对照品溶液Ⅰ1、5 μL，混合对照品溶液Ⅱ2、3、5、10 μL按“2.4.2.1”色谱条件进样，以进样量（μg）为横坐标，峰面积为纵坐标进行线性回归，得异绿原酸A、异绿原酸C 回归方程分别为y=3 296.4x+0.384 2（r=0.999 9）、y=3 493.8x-13.212 0（r=0.999 9），表明异绿原酸A、异绿原酸C分别在0.022 3～1.114 0 μg、0.012 3～0.617 0 μg范围内线性关系良好。

2.4.2.6 精密度试验 取树参茎样品（编号为11）按“2.4.1.3”项下方法制备的供试品溶液，按“2.4.2.1”色谱条件连续进样6次，计算异绿原酸A、异绿原酸C峰面积的RSD分别为0.03%、0.14%，表明仪器精密度良好。

2.4.2.7 稳定性试验 取树参茎样品（编号为11）按“2.4.1.3”项下方法制备供试品溶液，分别在0、2、4、8、12、24 h按“2.4.2.1”色谱条件进样测定，计算异绿原酸A、异绿原酸C峰面积的RSD分别为0.04%、0.15%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.4.2.8 重复性试验 精密称取同一批树参茎样品（编号为11）按“2.4.1.3”项下方法制备供试品6份，按“2.4.2.1”色谱条件进样测定含量，按干燥品计算异绿原酸A、异绿原酸C的含量分别为1.67、0.36 mg/g，RSD分别为0.62%、0.93%，表明方法重复性良好。

2.4.2.9 加样回收率试验 精密称取已知含量树参茎样品（编号为11）6份，按“2.4.1.3”项下方法制备供试品溶液，精密加入异绿原酸A、异绿原酸C对照品适量，按“2.4.2.1”色谱条件进样测定，计算回收率，结果显示异绿原酸A、异绿原酸C的平均加样回收率分别为98.32%、99.42%，RSD分别为0.86%、0.96%。（见表5）

表5 异绿原酸A、异绿原酸C 加样回收率试验结果

2.4.2.10 样品含量测定 取不同编号树参茎样品，取按“2.4.1.3”项下方法制备供试品溶液，按“2.4.2.1”色谱条件进样分析，按干燥品计算异绿原酸A、异绿原酸C含量。（见表4）根据测定结果制定限度：按干燥品计，含异绿原酸A应不低于0.047%，含异绿原酸C应不低于0.020%。

3 讨论

3.1 薄层色谱鉴别方法的选择 在紫丁香苷的薄层色谱鉴别方法中，比较了以下3个展开系统：（1）以氯仿-甲醇-水（6∶3∶1）的下层溶液为展开剂，使用硅胶G板，以10%硫酸乙醇溶液为显色剂，展开晾干后，105 ℃加热至斑点显色清晰；（2）以三氯甲烷-甲醇-水（15∶4∶0.2）为展开剂，使用硅胶G板，以10%硫酸乙醇溶液为显色剂，展开晾干后，105 ℃加热至斑点显色清晰；（3）以三氯甲烷-甲醇-甲酸（6∶1.2∶0.5）为展开剂，使用硅胶GF254薄层板，展开晾干后置紫外光灯（254 nm）下检视。通过比较发现，第3个展开系统紫丁香苷斑点清晰，与其他成分斑点分离度较好，比移值约为0.6，重现性好，故确定为紫丁香苷的薄层鉴别系统。

3.2 浸出物检测的意义及方法的选择 课题组前期分别采用水、20%乙醇、40%乙醇、60%乙醇、正丁醇对树参茎进行提取，结果60%乙醇树参茎提取物的抗炎作用为最佳。由于树参茎抗炎作用是化学成分群共同作用的结果，故除含量测定外，制订树参茎的醇溶性浸出物检测方法具有重要的意义。在浸出物方法学研究中，分别考察了不同测定方法（冷浸法、热浸法）对树参茎提取物的影响，结果发现使用60%乙醇采用热提法的提取率最高，故确定该条件为树参茎的浸出物检验方法。

3.3 含量测定方法的选择 因紫丁香苷和绿原酸极性较为接近，异绿原酸A和异绿原酸C极性较为接近且和紫丁香苷、绿原酸极性相差较大，故采用了两个含量测定系统分别测定上述4种成分。研究发现绿原酸、异绿原酸A、异绿原酸C的热稳定性较差，故采用超声作为样品的前处理方法。