池塘和稻田养殖环境下克氏原螯虾肠道菌群结构特征及其影响因素

殷文健 何 俊 李佳佳 陈焕根 张宪中*

（1．无锡市水产畜牧技术推广中心，江苏 无锡 214125；2．江苏省淡水水产研究所，江苏 南京 210017；3．江苏省渔业技术推广中心，江苏 南京 210036）

肠道微生物是机体中复杂且多样的生物系统，在宿主与肠道微生物长期共同进化的过程中，两者形成了相互协作、互利共生的关系[1]。正常生理状况下，肠道微生物处于动态平衡状态，且这种平衡与宿主的吸收代谢和免疫调节密切相关[2-3]。肠道微生物失衡会引起肠道疾病，危害宿主健康，影响养殖的经济效益。水产动物的肠道微生态系统极易受养殖环境的影响。研究表明，水温会影响水产动物肠道微生物的组成[4]，水体温度为18 ℃时，罗非鱼肠道微生物数量显著高于26 ℃[5-6]。Yang 等[7]报道，在稻田养殖模式中，泥鳅肠道菌群的多样性秋季比夏季高，并且邻单胞菌属只出现在夏季。夏季稻田养殖模式下的泥鳅肠道菌群中的厚壁细菌、乳酸菌属和链球菌属明显高于池塘养殖模式[7]，表明养殖环境直接影响水产动物的肠道微生物组成。

池塘和稻田养殖是目前克氏原螯虾主要的养殖模式，两种养殖模式下克氏原螯虾的肠道优势菌群相同，但是占比存在较大差异[8]。环境微生物会影响水产动物的肠道微生物的组成与微生态建立，养殖水体和底泥是水产动物养殖环境中重要部分。目前，不同养殖模式下动物肠道菌群的差异是否与养殖环境中微生物组成具有相关性仍需要进一步研究。因此，本研究在比较池塘和稻田养殖模式下克氏原螯虾肠道菌群组成差异的基础上，深入研究养殖环境（水体和底泥）微生物菌群对克氏原螯虾肠道菌群的影响，为池塘与稻田养殖模式下小龙虾的养殖管理和调控提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验设计与饲养管理

在江苏省无锡市选择3 口（1～2 hm2/口，水深1～1.5 m）克氏原螯虾养殖池塘，3块（4～6 hm2/块，水深1～1.5 m）水稻-克氏原螯虾综合种养田块。2021 年3 月25 日至4 月10 日，在池塘和稻田中陆续放养4～5 g/只克氏原螯虾（250～300 kg/hm2），于2021 年7 月8 日采集池塘和稻田内克氏原螯虾（25～32 g/只）、表层底泥和底层水样品，用于微生物菌群组成分析。养殖所用饲料为小龙虾配合颗粒饵料（苏州海大饲料有限公司），主要原料为鱼粉、豆粕、菜粕、虾壳粉、面粉、肉粉、磷酸二氢钙、氯化钠、复合维生素、微量元素等，营养水平为粗蛋白37%、粗纤维8%、粗灰分9%、水分10%、钙2%。

试验期间每天早晚投喂2 次饵料，保证3 h 内吃完。养殖期间，保证水源充足，根据水质和天气变化加注新水。试验期 90 d。

1.2 测定指标及方法

1.2.1 样品采集

使用地笼从每个池塘和稻田中各捕捞克氏原螯虾30 只，去除附肢，使用75%酒精浸泡15 min，无菌水漂洗4次（每次5 min），使用灭菌的湿棉球将虾尾部擦拭干净，拽拉尾部末端扯出整个肠道，使用镊子将肠道内容物挤至灭菌的5 mL离心管中，每个池塘和稻田中所有克氏原螯虾肠道内容物混合，于-80 °C 冻存[9]。利用采泥器采集池塘和稻田表层（15 cm）底泥样品，每个池塘和稻田采集中间和4个角落共5个点，混合，放入灭菌离心管中，于-80 °C 冻存。利用无菌玻璃瓶采集池塘和稻田的水体样品，每个池塘和稻田采集5 个点（100 mL/点），混合后低温高速离心，收集沉淀，于-80 °C冻存。

1.2.2 生长性能

试验开始和结束统计克氏原螯虾初始体重和终末体重，计算增重率和饵料系数。

1.2.3 DNA提取与高通量测序

参照Zoetendal等[10]的方法提取样品总DNA。样品经过涡旋处理后在低温条件下10 000 g离心15 min，将获得的沉淀转移至锆珠管中，加入十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）缓冲溶液对样品进行研磨处理，利用DNA提取液（北京索莱宝科技有限公司）对总基因组DNA进行抽提。样品经过经1% 琼脂糖凝胶电泳检测后，以NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific）测定DNA 纯度和含量。利用细菌16S rRNA 基因V4 区通用引物（515F：GTGCCAGCMGCCGCGGTAA；806R：GGACT ACHVGGGTWTCTAAT）[11]进行PCR 扩增、产物纯化、建库。利用Illumina HiSeq 2500 平台（Illumina）对检测合格的文库进行300×2 bp 测序。本研究中PCR 产物纯化、建库和测序在华大基因（BGI）完成，测序原始数据上传至NCBI（PRJNA757836）。

1.2.4 高通量测序结果分析

利用软件Cutadapt（3.4）[12]截掉测序数据的引物和接头，去除窗口平均质量低于20的末端碱基、含N的序列、片段长度小于225 bp的序列以及低复杂度的序列[13]。上述质量过滤后的序列导入Qiime2（2020.11）[14]进行嵌合体去除与双端拼接，所用软件为Dada2（1.20.0）[15]，前端序列保留长度230 bp，后端序列保留长度200 bp，其余参数为软件默认值。使用Vsearch（2.16.0）[16]对上述序列进行97%聚类，聚类方法为Open-reference，以Silva（123）数据库作为参考序列，其余参数设置为默认值。使用Mafft（7.4）[17]对代表性序列进行系统进化分析，并通过Qiime2 进行微生物菌群结构的Alpha 和Beta多样性分析和微生物物种注释（Silva 123）。

1.3 数据统计与分析

数据采用Excel 2020 进行初步整理，SPSS 20.0 进行相关性分析，利用非参数Kruskal-Wallis秩和检验比较差异，使用R 软件包进行微生物Spearman 相关性分析，使用GraphPad Prism 处理分析过的数据并作图。置信区间为95%，结果以“平均值±标准误”表示，P＜0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 不同养殖模式对克氏原螯虾生长性能的影响（见表1）

表1 不同养殖模式对克氏原螯虾生长性能的影响

由表1可知，不同养殖环境对克氏原螯虾的初均重、末均重、增重率和饵料系数影响不显著（P＞0.05）。

2.2 池塘与稻田养殖模式下克氏原螯虾肠道、水和底泥微生物多样性的影响

池塘和稻田养殖模式下克氏原螯虾肠道、水和底泥微生物菌群Observed_features 稀释曲线见图1。克氏原螯虾肠道、水体和底泥样品的高通量测序数据经过滤后，分别有62 197、56 902、57 657 条/样序列用于后续数据分析。

图1 池塘和稻田养殖模式下克氏原螯虾肠道、水和底泥微生物菌群Observed_features稀释曲线

由图1 可知，虾肠道、水和底泥微生物高通量测序深度足够，研究数据具有代表性。

不同养殖模式对肠道、水和底泥微生物Alpha多样性指数的影响见表2。由表2可知，与池塘养殖相比，稻田养殖虾肠道菌群Faith_pd 和Oberserved_features 指数具有下降趋势，水体微生物Pielou_evenness 和Shannon_entropy 指数均显著降低（P＜0.05），Faith_pd 指数具有下降趋势；底泥多样性指数无显著变化（P＞0.05）。

表2 不同养殖模式对肠道、水和底泥微生物Alpha多样性指数的影响

不同养殖模式下克氏原螯虾肠道、水和底泥微生物Beta多样性分析见图2。由图2可知，养殖模式能够明显影响虾肠道与水体微生物菌群结构，而对底泥微生物影响较小。

图2 不同养殖模式下克氏原螯虾肠道、水和底泥微生物Beta多样性分析

2.3 不同养殖模式对克氏原螯虾肠道菌群结构的影响（见图3）

图3 不同养殖模式对克氏原螯虾肠道菌群组成的影响

由图3 可知，克氏原螯虾肠道内优势菌门（相对丰度＞1%）有Proteobacteria、Firmicutes、Verrucomicrobia、Actinobacteria 等13 种；池塘虾肠道内相对丰度最高的菌门为Proteobacteria（19.98%），稻田虾肠道内相对丰度最高的菌门为Firmicutes（16.10%）。虾肠道内优势菌属（相对丰度＞0.5%） 有Candidatus Bacilloplasma、UnculturedChthoniobacterales、UnculturedRsaHF231等41 个；池塘虾肠道内相对丰度最高的属为UnculturedChthoniobacterales（9.45%），稻田虾肠道内相对丰度最高的属为Candidatus Bacilloplasma（9.44%）。

不同养殖模式下克氏原螯虾肠道菌群差异分析见表3。由表3可知，与池塘养殖相比，门水平上，稻田虾肠道内Fusobacteria 的相对丰度显著增加（P＜0.05），Actinobacteria和Cyanobacteria的相对丰度有增加的趋势，Verrucomicrobia 的相对丰度显著降低（P＜0.05）。Acidobacteria 和Proteobacteria 的相对丰度有降低的趋势。与池塘养殖相比，在属水平上，稻田虾肠道内Planktothrix、UnculturedActinobacteria、Methylocaldum、Luteolibacter、 Mycobacterium、UnculturedRhizobiales、Desulfocapsa、Synechococcus、Uncultured PeM15 的相对丰度显著增加（P＜0.05）；UnculturedChthoniobacterales、UnculturedChthoniobacterales、UnculturedAnaerolineaceae、UnculturedMycoplasmataceae的相对丰度显著降低（P＜0.05）。

表3 不同养殖模式下克氏原螯虾肠道菌群差异分析

2.4 池塘与稻田水体微生物结构分析（见图4、表4）

图4 池塘与稻田水体微生物组成

表4 池塘与稻田水体微生物差异分析

由图4 可知，水体微生物优势菌门（相对丰度＞1%）有Proteobacteria、Cyanobacteria、Actinobacteria 等10 种，其中池塘水体Proteobacteria丰度最高（34.17%），而稻田水体中丰度最高的菌门为Cyanobacteria（41.69%）。水体微生物优势菌属（相对丰度＞0.5%） 有UnculturedCyanobacteria、 UnculturedSporichthyaceae、 UnculturedComamonadaceae等38 个，其中池塘水体UnculturedSporichthyaceae丰度最高（12.01%），而稻田水体中丰度最高的菌属为UnculturedCyanobacteria（21.34%）。

由表4 可知，在门水平上，与池塘相比，稻田水体Fusobacteria 门相对丰度显著增加 （P＜0.05），Verrucomicrobia 相对丰度显著降低 （P＜0.05），Actinobacteria 和Cyanobacteria 相对丰度有增加的趋势，Acidobacteria、Proteobacteria相对丰度有降低的趋势。在属水平上， 与池塘相比， 稻田水体UnculturedCyanobacteria等13 个属相对丰度显著增加（P＜0.05），UnculturedSporichthyaceae等18 个属相对丰度显著降低（P＜0.05），UnculturedComamonadaceae属相对丰度有降低的趋势。

2.5 池塘与稻田底泥微生物结构分析（见图5、表5）

图5 池塘与稻田底泥微生物组成

表5 池塘与稻田底泥微生物差异分析

由图5 可知，底泥优势（相对丰度＞1%）菌门有Proteobacteria、Chloroflexi、Acidobacteria 等11 种；相对丰度最高的门均为Proteobacteria（36.79%、31.23%）。底泥优势 （ 相对丰度＞0.5%） 菌属有UnculturedAnaerolineaceae、 UnculturedAcidobacteria、 UnculturedXanthomonadales等38 个；相对丰度最高的属均为UnculturedAnaerolineaceae（9.41%、10.00%）。

由表5 可知，与池塘相比，稻田底泥Firmicutes 门和Marmoricola属相对丰度显著增加（P＜0.05），UnculturedNitrospinaceae和UnculturedDesulfobacteraceae属相对丰度显著降低（P＜0.05），Actinobacteria 相对丰度有增加的趋势，Defluviicoccus属相对丰度具有降低的趋势。

2.6 养殖环境（水、底泥）对克氏原螯虾肠道菌群结构的影响（见图6、表6）

图6 池塘与稻田养殖模式下克氏原螯虾肠道、水及底泥微生物相关性分析

表6 克氏原螯虾肠道优势菌属与底泥和水体微生物相关性分析

由图6 可知，虾肠道微生物菌群与底泥和水体微生物菌群均存在显著正相关关系（P＜0.05），且虾肠道微生物与底泥微生物的相关性更高。

由表6 可知，虾肠道、水体和底泥优势菌属间的相关性分析（P＜0.05 且相关系数绝对值＞0.8）显示，共有29 个肠道优势菌属与底泥和水体微生物显著相关，其中23 个与底泥微生物显著相关，22 个与水体微生物显著相关，16 个与底泥和水体微生物均显著相关。Verrucomicrobiaceae两个未知属、Cyanobacteria未知属及Luteolibacter主要受底泥微生物影响， 而Chthoniobacterales未知属及Planktothrix主要受水体微生物影响。

3 讨论

3.1 不同养殖模式对克氏原螯虾生长性能、肠道菌群结构的影响

克氏原螯虾的生长受到诸多因素的影响。本试验中，克氏原螯虾的体生长性能在不同的养殖模式下无显著差异。可能是因为本研究中克氏原螯虾的放养密度和水草覆盖度适中。

肠道微生物可以调节肠道环境，促进肠道菌群平衡，维护宿主健康[18]。在宿主与肠道菌群长期共同进化的过程中，某种或某些特殊的微生物会定植在肠道中，形成该宿主肠道内的核心菌群[19]。核心菌群很少受到宿主驯养状态和饲养环境的影响。Tzeng等[20]发现，不同栖息环境中日本沼虾的肠道核心菌群主要为变形菌门，其次为厚壁菌门和放线菌门。本试验研究发现，两种饲养模式下小龙虾的核心菌群主要为变形菌门，其次是厚壁菌门和疣微菌门，与上述研究结果相类似。有研究表明，水生动物肠道菌群的结构组成受遗传、饲养环境和饲料组成等因素影响[21]。严雪瑜等[22]报道，稻田养殖模式下的鲤鱼肠道菌群多样性高于池塘养殖模式。在本试验中，稻田养殖模式下虾肠道菌群多样性低于池塘养殖模式，这可能是稻田水体环境中微生物多样性偏低导致。本研究后续比较池塘和稻田水体微生物多样性发现，稻田水体中微生物多样性显著低于池塘。从门的分类水平上可见，在稻田养殖模式下克氏原螯虾肠道放线菌门的相对丰度显著增加。放线菌是肠道的优势菌群，具有产生短链脂肪酸的能力，并且其代谢产物具有抑菌活性[23]。本研究发现，在属水平上，稻田养殖模式下克氏原螯虾肠道囊裸藻属（Trachelomonas）相对丰度降低，而浮丝藻属 （Planktothrix） 相对丰度增加。 囊裸藻属（Trachelomonas）分布较广，为湖泊、沼泽等静水水体中常见的浮游微生物，其大量繁殖时使水呈棕褐色。稻田养殖模式下克氏原螯虾肠道放线菌和囊裸藻属（Trachelomonas）相对丰度改变的原因可能与稻田水质的改善有着紧密联系。根据上述结果可以推测，稻田养殖模式下克氏原螯虾肠道微生物结构可能更健康。

3.2 稻田与池塘水体微生物组成对克氏原螯虾肠道微生物的影响

水生动物的消化道短，肠道微生物极易受水环境的影响[24]。研究表明，微生物可以通过水环境引起水生动物肠道菌群结构发生改变[25]。本研究中，水体微生物的主要菌门为变形菌门、蓝藻门、放线菌门和疣微菌门，这与克氏原螯虾肠道的优势菌群基本一致。稻田水体微生物多样性显著低于池塘水体，造成这一结果的原因可能是水稻大量吸收水体中的营养素，水体清瘦，导致微生物数量较少[26]。本试验中，在门水平，稻田水体微生物的变形菌门，放线菌门和疣微菌门相对丰度显著低于池塘水体，而蓝藻门相对丰度显著高于池塘水体。所有的变形菌门细菌为革兰氏阴性菌，其外膜主要由脂多糖组成，因此该门包括很多致病菌[27]；放线菌门会促使土壤中的动物和植物腐烂，同时放线菌具有一种土霉味。因此，推测稻田水体中变形菌门和放线菌门相对丰度较低表明稻田中水质更好。本试验中，在属水平，稻田水体微生物鱼孢菌科（Uncultured Sporichthyaceae）、蓝藻细菌（Cyanobacteria）和聚球藻属（Synechococcus）相对丰度显著高于池塘水体。这可能是由于稻田充足的阳光照射刺激了蓝藻菌属生长，也可能是因为稻田水质较好菌群多样性低，蓝藻菌属对营养物质的竞争压力减小[28]。

3.3 稻田与池塘底泥微生物组成分析

池塘和稻田底泥中主要的微生物菌门为变形菌门、绿弯菌门、酸杆菌门、放线菌门等[29]。本研究结果显示，池塘与稻田底泥微生物多样性没有显著差异，在门和属水平上，微生物菌群结构的差异也不大。研究表明，植物种植可以引起土壤中微生物群落组成和丰度的变化，植物能够通过对土壤养分和水分的吸收以及根系分泌物的释放来调控周围的土壤，从而对微生物施加选择性压力[30-31]。本研究发现，池塘和稻田底泥微生物菌群结构差异不大，可能是养殖克氏原螯虾池塘内种植的水草也具有相似的土壤调控作用。

3.4 底泥与水体对克氏原螯虾肠道菌群结构的影响

本研究中的相关性分析结果表明，克氏原螯虾肠道菌群结构与底泥和水体微生物均具有显著正相关关系，表明虾肠道微生物菌群结构受底泥和水体微生物的正向调控。而虾肠道微生物菌群与底泥微生物相关性更强，表明底泥微生物菌群对虾肠道微生物的影响更大，与在南美对虾和小龙虾上的研究结果相一致[32-33]。因此，可推测这一结果可能与克氏原螯虾的生活习性密切相关，小龙虾具有穴居性，洞穴深度一般在30 cm左右，此外小龙虾会采食底泥中的腐殖质有机碎屑[34]。

4 结论

池塘和稻田两种养殖模式下克氏原螯虾肠道菌群结构差异显著，受养殖环境水和底泥的正向调控，其中受底泥微生物的影响更大。