肌球蛋白轻链激酶在肠梗阻发生及肠黏膜屏障损伤中的作用

王 玉,庄 波,陈晓俊,杨仪晖

(浙江大学医学院附属金华医院 1.检验科;2.普外科,浙江 金华 321000;3.金华市第二医院 老年科,浙江 金华 321000;4.浙江大学医学院附属金华医院 病理科,浙江 金华 321000)

肠梗阻是任何原因引起的肠内容物通过障碍,是外科常见的急腹症之一,死亡率一般为5%～10%。败血症是肠梗阻死亡的主要原因[1],肠道上皮黏膜屏障的破坏,紧密连接(tightjunction,TJ)的打开是败血症发生的重要原因之一[2-3]。肌球蛋白轻链激酶(myosin light chain kinase,MLCK)可以使肌球蛋白轻链磷酸化(myosin light chain phosphorylation,pMLC),促使肌动蛋白收缩,从而使肠道平滑肌收缩,增加TJ和细胞表面的张力,破坏细胞间的紧密连接,开放TJ[4-5]。国内外许多动物实验研究[6-7]证实,MLCK在肠道中起着至关重要的作用。本研究比较肠梗阻患者的病变组织和正常组织的组织结构改变和细胞凋亡的差异,肠组织肌层和黏膜层MLCK和pMLC的表达差异,紧密连接蛋白(zonula occludens-1,ZO-1)的表达差异,以及肠梗阻患者手术前后血液中MLCK含量的变化,探究MLCK和pMLC在肠梗阻患者肠道及肠黏膜屏障中的作用,检测血液中MLCK的含量对于判断肠黏膜屏障损伤的意义。

1 材料和方法

1.1 临床资料 选取2018年1月—2020年3月在金华市中心医院因肠梗阻进行手术的患者28例为观察组,另选取同期年龄性别相仿的健康体检者30例为对照组。观察组中男18例、女10例,平均年龄(57.28±6.98)岁,小肠段梗阻22例、回肠段梗阻6例。所有病例术中均见梗阻肠近段扩张,远端狭窄,为梗阻表现;术后病理诊断符合肠梗阻表现;排除因肿瘤、单纯狭窄、肠套叠、寄生虫等非动力原因引起的梗阻。组织标本选取患者的狭窄部肠段和正常无变化肠段。对照组中男20例、女10例,平均年龄(57.83±6.83)岁;观察组和对照组年龄、性别占比差异无统计学意义(P>0.05)。所有研究对象知情同意,本研究经过金华市中心医院医学伦理委员会批准。

1.2 主要材料 苏木素购自上海展云化工,倒置荧光显微镜购自日本的Olympus公司,TUNEL细胞凋亡检测试剂盒购自碧云天公司,MLCK、pMLC、ZO-1、β-actin抗体均购自英国的Abcam公司,兔二抗、鼠二抗、DAB显色试剂盒购自中杉金桥,蛋白酶K购自德国Biofroxx公司,组织蛋白提取试剂盒、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂、BCA蛋白浓度测定试剂盒均购于美国Thermo Fisher,MLCK酶联免疫试剂盒购于上海江莱生物。

1.3 血液学检测 采集肠梗阻患者手术前和手术后3天,以及健康体检者的外周静脉血5 mL,置于钝性分离胶试管中,采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测MLCK的含量。按试剂盒上的操作步骤严格操作,450 nm波长处测定OD值。

1.4 组织标本检测

1.4.1 HE染色 手术切除的病变肠组织和肠旁正常组织立即置入4%多聚甲醛中固定24 h后做组织病理切片,显微镜下观察肠组织病理变化情况。根据Chiu评分法评价肠道黏膜损伤等级:0为正常肠黏膜绒毛;1级为在绒毛中轴出现肠黏膜上皮下的Gruenhagen’s间隙,常常伴随毛细血管充血;2级为来自固有膜的肠黏膜上皮抬高及肠上皮下间隙的扩张;3级为大片肠黏膜上皮抬高,绒毛向两侧倒伏,部分绒毛顶端脱落;4级为绒毛及固有膜脱落,裸露的毛细血管扩张,可见固有膜细胞成分构成增加;5级为固有膜脱变或被消化,出血或溃疡形成。

1.4.2 Tunel 细胞凋亡检测 严格按照碧云天细胞凋亡检测试剂盒步骤进行操作,其中滴加20 μg/mL不含DNase的蛋白酶K,20 ℃～37 ℃作用20 min,滴加按说明书配置的TdT反应液50 μL,37 ℃避光孵育60 min,滴加50 μL Streptavidin-HRP标记液,37 ℃避光孵育30 min。显微镜下统计整张玻片相应部位细胞核被染色成深棕色的凋亡细胞数量。

1.4.3 免疫组织化学检测 石蜡组织切片经二甲苯和不同浓度酒精脱水后,进行免疫组织化学检测,显微镜下观察MLCK和pMLC在梗阻肠段肌层和黏膜层的表达情况。

1.4.4 Western blot(WB) 检测 手术获得肠组织,选取病变部位和正常部位肠组织样本,用蛋白提取试剂盒提取蛋白,并用BCA蛋白浓度试剂盒测蛋白浓度,进行WB检测,用ECL试剂盒显影,并观察分析蛋白表达量。

1.5 统计学方法 应用SPSS 24.0软件处理数据。计数资料用(%)表示,组间比较采用χ2检验;计量资料以均值±标准差表示,2组间比较采用独立样本t检验,多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 外周血中MLCK含量 对照组和观察组手术前、后外周血MLCK的含量分别为(1.52±1.16) g/L、(12.56±4.11) g/L、(2.04±0.83) g/L,三组差异有统计学意义(F=177.69,P<0.001);观察组术后外周血MLCK的含量和正常对照组差异无统计学意义(t=0.80,P=0.423)。

2.2 肠组织病理变化 HE染色显示,梗阻部位肠组织结构破坏,相较于正常肠组织有大量上皮细胞脱落,少量绒毛裸露,肠道黏膜损伤分级Chiu评分3级。Tunel细胞凋亡检测显示,肠梗阻部位组织的凋亡细胞(31.66±4.04)多于正常肠组织(1.33±1.53),差异有统计学意义(t= -12.16,P<0.05)。见封三图3。

2.3 MLCK和pMLC在梗阻肠段肌层和黏膜层的表达水平 免疫组化检测显示,梗阻部位肠组织肌层和黏膜层MLCK、pMLC的表达均高于正常肠组织,差异有统计学意义(均P<0.01)。见封三图4、5。

2.4 梗阻段MLCK、pMLC、ZO-1的表达水平 WB检测结果显示,相较于正常肠段,梗阻段的MLCK(0.7632±0.3423)、pMLC(0.6399±0.2239)表达升高,ZO-1表达(0.1445±0.1430)降低,差异均有统计学意义(t=-30.145、10.793、-13.807,均P<0.01)。见图1。

注:**P<0.01。图1 MLCK、pMLC、ZO-1的 WB检测结果(A)和灰度比值统计柱状图(B)Figure 1 WB detection results (A) and histogram of gray ratio statistics (B) of MLCK、pMLC、ZO-1

3 讨论

MLCK是一种依赖于Ca2+-钙调蛋白的激酶,存在于不同组织中,其中平滑肌MLCK负责肌肉收缩的启动,决定其最大缩短速度和最大缩短能力,当Ca2+浓度升高时,通过催化MLC磷酸化激活横桥ATP酶,兴奋肌肉收缩偶联,使细肌丝向粗肌丝滑行,进而产生收缩效应[8]。肠梗阻是多种原因引起的肠道内容物通过障碍,按病因可分为机械性肠梗阻、动力性肠梗阻、血运性肠梗阻,按照肠壁血循环可分为单纯性肠梗阻和绞窄性肠梗阻。动力性肠梗阻的患者肠道蠕动功能丧失或肠道痉挛是其产生肠梗阻的原因。本研究选取肠梗阻手术患者为观察对象,术后病理结果排除因肿瘤、单纯狭窄、肠套叠、寄生虫等非动力原因引起的梗阻,可以更好地说明单纯肠梗阻发生时MLCK的作用。

本研究HE染色可见梗阻肠道上皮细胞凋亡增加,组织破坏,符合肠梗阻的基本病理表现。免疫组化发现MLCK及pMLC在肠梗阻段的肌层以及黏膜层表达均升高,肌层的表达升高证明肠梗阻发生时肠道处于收缩痉挛的状态,这是造成内容物不能正常通过的原因,和国内外众多学者通过动物或细胞实验研究MLCK在肠梗阻中的作用结果相似[9-10]。

肠道黏膜层的表达升高可能和肠黏膜屏障的破坏有关。国内外众多研究表明,MLCK及pMLC在非酒精性脂肪肝、胰腺炎、炎症性肠病等患者的肠黏膜中都存在表达升高的情况[11-13],研究者认为这和肠道黏膜屏障的破坏有关。肠黏膜屏障分为四层:生物屏障、机械屏障、免疫屏障、化学屏障[14],肠黏膜的通透性主要与机械屏障有关,机械屏障由肠上皮细胞及其连接构成,肠上皮间的连接包括紧密连接(tightjunction,TJ)、缝隙连接(gapjunction,GJ)、黏附连接(adhesionjunction,AJ)及桥粒(desmosome)等,其中TJ最重要,ZO-1是其中重要的一个蛋白。炎症因子如TNFα、LPS等可以通过活化MLCK,引起肌球蛋白轻链磷酸化,使TJ打开,从而使肠黏膜屏障遭到破坏[14],我们通过免疫蛋白印迹实验得到MLCK和pMLC在梗阻肠道表达升高而ZO-1表达降低的结果,显示梗阻段肠黏膜紧密连接打开,黏膜屏障破坏和MLCK的作用相关。

此外,本研究还利用ELISA的方法测定肠梗阻患者手术前后外周血中MLCK的含量,并与正常体检人群外周血中的含量进行对比,发现在梗阻发生时血液中MLCK的含量升高,当梗阻解除后含量和正常者无差异。熊庄莉等[15]曾做过哮喘患者血清中MLCK含量和肺功能的关系研究,发现在哮喘患者中MLCK高表达,且与肺功能呈正相关,她认为血液中高表达的MLCK提示其在哮喘中的作用。本研究结果间接说明通过血液中MLCK的含量可以了解肠道平滑肌和肠黏膜屏障的状态。

综上,本研究证实肌球蛋白轻链激酶在肠梗阻的发生和肠黏膜屏障破坏中起着重要作用,并且梗阻发生时血液中MLCK的含量升高,梗阻解除后含量恢复和正常对照无差异,对于后期研究肠梗阻早期诊断标志物,判断肠黏膜屏障功能是否破坏,以及抑制MLCK表达从而达到治疗肠梗阻的作用提供一定的基础。但由于本研究样本量不够大,以及研究方法的局限性,还需要大量的实验来进一步研究MLCK对于肠梗阻的作用。